徐 婷 袁青青 陳 娟 龔 毅 劉曉龍 錢海兵

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

苗醫(yī)“五基成物學(xué)說”中認為，光、氣、水、土、石是構(gòu)成世界的基本元素，其中石是構(gòu)成人體的基本元素之一。石的質(zhì)地堅硬，用以構(gòu)造人體的骨骼以支撐起人體的肢體、構(gòu)成牙齒以咀嚼各種食物，是人體支架的基本物質(zhì)[1]。根據(jù)苗醫(yī)描述，可以認為這里的石類元素事實上是為礦物質(zhì)的代表，如鈣、磷、鋅等。故當機體吸收石類元素的能力較弱或是所吸收不足時，必然導(dǎo)致骨虛，即“石弱骨虛”。針對這一病理狀態(tài)，常以補火藥進行治療以達到補石健骨、補精水、填骨髓的治療目的[2]。

淫羊藿性溫，味甘、辛，主要具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕、助陽益精的功效，臨床常用于陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣等癥。藥理學(xué)研究表明，淫羊藿能夠提高免疫力、增強性功能、抗腫瘤、降血糖、抗炎、治療骨質(zhì)疏松等[3]。

近年來，苗醫(yī)藥的研究日漸增多，苗藥產(chǎn)業(yè)成為產(chǎn)值最大的民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)之一，但對于苗醫(yī)藥的基礎(chǔ)研究相對較少，特別是適合苗藥研究的實驗動物模型更是少有研究，這也成為苗醫(yī)要理論系統(tǒng)研究和產(chǎn)業(yè)化的深度發(fā)展的瓶頸之一。本研究將在重大基礎(chǔ)課題的支持下，依據(jù)苗醫(yī)藥的記載，“石弱骨虛”是因為骨髓不足，骨失濡養(yǎng)和機體吸收石類元素不足所致[1]，故本研究將以“石弱骨虛”理論為指導(dǎo)，以促進動物機體石類元素的流失和減少動物機體對石類元素的吸收為建模依據(jù)，采用去除大鼠雙側(cè)卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸鈉+給予2.5%氯化鍶水溶液的方法復(fù)制“石弱骨虛”模型，再在以方測證的研究方法下，采用貴州地區(qū)常用的改善“石弱骨虛”證候的幾種淫羊藿：粗毛淫羊藿(E.acuminatum)、黔嶺淫羊藿(E.leptorrhizum)和巫山淫羊藿(E.wushanense)進行干預(yù)，探索復(fù)制“石弱骨虛”模型，并揭示苗藥淫羊藿治療“石弱骨虛”的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵，以期為苗醫(yī)藥基礎(chǔ)研究提供符合苗醫(yī)藥基本學(xué)說的實驗動物模型。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠40只，體重(200±20)g，動物飼料均由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥品和試劑 雌二醇(E2，批號：C0139050102)、鈣離子(Ca2+，批號：Cat#：DALP-048)、25羥基維生素D3(25(OH)D3，批號：C0139030100)、1,25二羥基維生素D3(1，25(OH)2D3，批號：C0139040101)、骨鈣素(BGP，批號：V15013956)、堿性磷酸酶(ALP，批號：Cat#：DICA-048)均購于武漢華美生物科技有限公司；磷(P)測試盒(磷鉬酸法)(批號：20180706，南京建成生物工程研究所)；水合氯醛(批號：20180627，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；氯化鍶(批號：20180110，成都科隆化學(xué)品有限公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(批號：180209283，鄭州卓峰制藥有限公司)。

粗毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿、巫山淫羊藿均購于貴陽市南明區(qū)萬東橋藥材市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室劉曉龍博士鑒定為對應(yīng)藥物。淫羊藿水煎液供試品的制備：各淫羊藿水沖洗棄其雜物，取定量淫羊藿，加20倍量水浸泡30 min，煎煮2 h，第二次加入10倍量水，同樣煎煮2 h，合并兩次煎煮液，過濾，最后濃縮至相當于生藥材1 g/ mL淫羊藿水提液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器 離心機，Thermost16R,賽默飛世爾公司；DRHH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設(shè)備有限公司)；infiniteM200酶標儀(北京新風(fēng)機電技術(shù)公司)。

2 方法

2.1 “石弱骨虛”大鼠模型的制備 采用復(fù)合模型(去除大鼠雙側(cè)卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸鈉+給予2.5%氯化鍶水溶液)進行模擬造模。40只大鼠隨機分為空白組8只和實驗組32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。除空白組外，其余大鼠均進行造模，復(fù)合模型(去除大鼠雙側(cè)卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸鈉+給予2.5%氯化鍶水溶液)，去除雙側(cè)卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，并肌肉注射20萬U/kg青霉素，連續(xù)3 d。去卵巢后第四天開始，除空白組外，其余大鼠均肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液(1 mg/kg，一周兩次)，同時每天給予2.5%氯化鍶自來水溶液自由飲水，避光飼養(yǎng)，模型制備共計2個月。

2.2 分組及干預(yù) 實驗組均進行造模處理，將造模成功后的32只大鼠隨機分為以下4組：模型組、粗毛淫羊藿組、黔嶺淫羊藿組、巫山淫羊藿組，每組8只，灌胃給藥，1次/d，三組淫羊藿組灌胃劑量均為4g/kg(按照人臨床劑量折算，相當于人臨床劑量的8倍)；空白組、模型組灌胃等體積的飲用水；連續(xù)給藥2個月。

2.3 標本制備 實驗時間到4個月時，所有大鼠取材前一晚禁食不禁水12 h，并進行稱重，4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，靜置2 h，3000 rpm離心10 min，分離血清，并將血清分裝在小EP管中，-80 ℃冰箱保存，備用。取大鼠左側(cè)股骨與脛骨，并分別稱重，記錄。

2.4 指標的檢測

2.4.1 大鼠脛骨和股骨的重量 取大鼠左側(cè)股骨與脛骨，并分別稱重，記錄。

2.4.2 ELISA試劑盒檢測 取大鼠血清測定E2、Ca2、P、25(OH)D3、1,25(OH)2D3、BGP、ALP，嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。

3 結(jié)果

3.1 脛骨和股骨重量結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠脛骨和股骨重量均顯著降低(P<0.01)，提示模型組大鼠骨重量降低，骨健康程度嚴重下降，與苗醫(yī)“石弱骨虛”表述相對應(yīng)，顯示造模成功；與模型組比較，黔嶺淫羊藿組和巫山淫羊藿組脛骨和股骨重量有所升高(P<0.05)，粗毛淫羊藿組大鼠脛骨重量所增加(P<0.05)，提示三種淫羊藿作為常用苗藥可在一定程度上使“石弱骨虛”模型大鼠骨重量增加，改善大鼠的骨健康程度。結(jié)果見表1。

表1 藥物干預(yù)對各實驗組大鼠脛骨和股骨重量的影響

3.2 血清生化指標檢測

3.2.1 對大鼠血清中E2、Ca2+、P含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中E2、Ca2+、P含量顯著降低(P<0.01)，提示造模之后，模型組大鼠骨形成與骨吸收動態(tài)平衡被破壞，進一步導(dǎo)致大鼠骨礦化速率受到嚴重抑制，與“石弱骨虛”臨床表現(xiàn)相對應(yīng)，顯示造模成功；與模型組比較，黔嶺淫羊藿組大鼠血清中E2、Ca2+、P含量均明顯升高(P<0.05)，粗毛淫羊藿組大鼠血清中Ca2+和P含量均明顯升高(P<0.05)，巫山淫羊藿組大鼠血清中E2含量明顯升高(P<0.05)，提示三種淫羊藿作為常用苗藥可在一定程度上促進大鼠骨形成，抑制大鼠骨吸收，進一步使骨吸收與骨形成保持動態(tài)平衡，改善“石弱骨虛”骨代謝。結(jié)果見表2。

表2 藥物干預(yù)對各實驗組大鼠血清中E2、Ca2+、P含量的影響

3.2.2 對大鼠血清中25(OH)D3和1,25(OH)2D3含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中25(OH)D3和1,25(OH)2D3含量顯著降低(P<0.01)，提示造模之后，模型組大鼠腸道對鈣磷元素的吸收減少，與苗醫(yī)“石弱骨虛”理論描述接近，顯示造模成功；與模型組比較，粗毛淫羊藿組和巫山淫羊藿組大鼠血清中的25(OH)D3和1,25(OH)2D3含量明顯升高(P<0.05)，提示三種淫羊藿作為常用苗藥可在一定程度上增加腸道對鈣磷元素的吸收，從而提高骨健康程度。結(jié)果見表3。

表3 藥物干預(yù)對各實驗組大鼠血清中25(OH)D3和1，25(OH)2D3含量的影響

3.2.3 對大鼠血清中BGP和ALP含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中BGP和ALP含量顯著降低(P<0.01)，提示造模之后，模型組大鼠成骨細胞活性嚴重下降，從而導(dǎo)致骨形成受到嚴重的抑制，與“石弱骨虛”模型相對應(yīng)，顯示造模成功；與模型組比較，巫山淫羊藿組和粗毛淫羊藿組大鼠血清中BGP和ALP含量明顯升高(P<0.05)，黔嶺淫羊藿組大鼠血清中BGP含量明顯升高(P<0.05)，提示三種淫羊藿作為常用苗藥可在一定程度上增加成骨細胞的活性，從而促進骨形成。結(jié)果見表4。

表4 藥物干預(yù)對各實驗組大鼠血清中BGP和ALP含量的影響

4 討論

苗醫(yī)理論中認為“石弱骨虛”這一病癥多由氣血虧損，或營養(yǎng)不足，耗量過大以致血虧氣短，久則累積骨質(zhì)而成疾，或先天稟賦不足，壯年房事過多，耗氣耗血，傷腎成疾?？杀憩F(xiàn)為：腰背疼痛、四肢無力、雙腿酸軟和足跟骨痛等癥狀[2]，與臨床所見骨質(zhì)疏松癥狀有一定的相似性。因此，本實驗通過去除大鼠雙側(cè)卵巢和對大鼠進行肌肉注射糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致大鼠體內(nèi)鈣元素的大量流失，誘發(fā)骨質(zhì)疏松；并且以高濃度(2.5%)氯化鍶抑制鈣吸收作為切入點，以模擬苗醫(yī)學(xué)“石弱骨虛”證病因中因氣血虧虛，營養(yǎng)不足，石類元素攝入不足的發(fā)病機制，進行“石弱骨虛”模型的制備。因而本實驗通過去除大鼠雙側(cè)卵巢模擬絕經(jīng)后機體雌激素降低和鈣大量流失的“石弱骨虛”狀態(tài)[4-6]，并以超生理劑量的糖皮質(zhì)激素造成石類元素的流失，進一步導(dǎo)致骨虛。氯化鍶是一種水溶性物質(zhì)，低濃度的氯化鍶促進鈣吸收，高濃度氯化鍶(2.5%～4%)抑制25(OH)D3合成，減弱腸道對鈣的吸收，損害骨礦化，導(dǎo)致骨骼發(fā)育障礙[4-6]。

骨是雌二醇(E2)發(fā)揮作用的重要靶器官之一，在多種骨細胞中(如成骨細胞和破骨細胞等)，均有雌激素受體α和β的存在。E2是卵巢分泌的一類類固醇激素，是雌激素的主要組成部分。研究表明，E2在維護皮質(zhì)骨的形成、支持成骨細胞、防止骨吸收、抑制破骨細胞形成和刺激破骨細胞凋亡中發(fā)揮了主導(dǎo)作用[8]。E2含量降低可導(dǎo)致大鼠骨形成與骨吸收動態(tài)平衡被破壞，進而抑制大鼠骨礦化速率。“石弱骨虛”模型復(fù)制后，與空白組比較，模型組大鼠骨健康程度降低，骨重量減輕，骨質(zhì)流失，E2含量降低；淫羊藿治療后，對比模型組，E2含量恢復(fù)接近于正常水平。說明淫羊藿可促進大鼠骨形成，抑制大鼠骨吸收，進而使骨吸收與骨形成保持動態(tài)平衡。

人體99%的鈣與磷酸和羥基結(jié)合形成羥基磷灰石晶體，貯存于骨骼和牙齒，是骨形成和骨重建階段所必需的物質(zhì)。 骨鈣代謝包括骨形成和骨吸收兩個過程，在生化過程中通過離子交換，使鈣的吸收和釋放相等，保持骨鈣的動態(tài)平衡。磷是組成骨骼中無機鹽的重要組分，亦是參與骨代謝的重要無機營養(yǎng)素，與鈣以 1∶2左右比例結(jié)合形成骨礦物質(zhì)[9]。“石弱骨虛”模型復(fù)制后，與空白組比較，模型組大鼠Ca2+、P含量降低；淫羊藿治療后，對比模型組，Ca2+、P含量恢復(fù)接近正常水平。說明淫羊藿可抑制骨吸收，促進骨礦化，進而穩(wěn)定血鈣、磷的含量。

維生素D是一種脂溶性維生素，包括維生素D3(VD)3和維生素D3(VD)2兩種形式，是通過調(diào)節(jié)腸道鈣吸收途徑中的多種蛋白的結(jié)構(gòu)或表達水平影響鈣的吸收，維生素D經(jīng)過肝臟羥化作用變成為25(OH)D3，它是維生素D的前體，也是維生素D最穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，經(jīng)過腎臟再羥化成1,25(OH)2D3，被稱為骨化三醇，1,25(OH)2D3可與維生素D受體結(jié)合作用于DNA上的一個由200多個基因組成的片段，活化后調(diào)控基因表達，調(diào)節(jié)腸道對鈣、磷的吸收，維持血鈣、磷水平，保證骨骼和牙齒的正常生長發(fā)育[10]?！笆豕翘摗蹦Ｐ蛷?fù)制后，與空白組比較，模型組大鼠25(OH)D3、1,25(OH)2D3含量減少；淫羊藿治療后，對比模型組，25(OH)D3、1,25(OH)2D3含量升高。說明淫羊藿可促進腸道對鈣、磷的吸收，維持血鈣、磷的平衡，恢復(fù)骨健康程度。

BGP是由成熟的骨細胞和成骨細胞合成與分泌，是成骨細胞的標志，在骨組織礦化和成骨細胞分化增加時，骨鈣素也隨之特異增加，所以其含量的多少可間接反應(yīng)成骨細胞的活性[11]。主要生理功能是維持骨的正常礦化速度，可直接反映骨形成的狀況[12]。ALP存在各種組織中，如肝、腎、骨、小腸等，其中有50%的ALP來源于骨組織。骨組織中的ALP由成骨細胞合成，它能在堿性條件下，水解骨鈣化區(qū)域中的磷脂，釋放磷酸根，釋放的磷酸基團可與鈣發(fā)生結(jié)合，以沉淀的形式沉積在膠原骨架上，在骨礦化中起到重要作用[13]。ALP可以破壞鈣化抑制劑，使得鈣和磷可結(jié)合到膠原分子的膠原氨基酸殘基上，進而使成骨細胞鈣化加強[14]?！笆豕翘摗蹦Ｐ蛷?fù)制后，與空白組比較，模型組大鼠BGP、ALP含量降低；淫羊藿治療后，BGP、ALP含量恢復(fù)接近于正常水平。說明苗醫(yī)常用的三種淫羊藿可提高成骨細胞活性促進骨形成，穩(wěn)定骨礦化速率。

本實驗復(fù)制“石弱骨虛”模型后結(jié)果顯示，大鼠脛骨、股骨重量、E2、Ca2+、P、25(OH)D3、1,25(OH)2D3、 BGP、ALP含量均降低，說明該模型可以導(dǎo)致大鼠骨形成減少，骨吸收增加，骨礦化速率被抑制，這些病理過程的變化與臨床“石弱骨虛”病人的病理過程基本相似，其癥狀表現(xiàn)與四肢無力、雙腿酸軟和足跟骨痛也有相似之處。說明本實驗所復(fù)制的復(fù)合模型(去除大鼠雙側(cè)卵巢+肌肉注射地塞米松磷酸鈉+給予2.5%氯化鍶水溶液)可在一定程度上與苗醫(yī)理論中“石弱骨虛”的含義相對應(yīng)，表明模型大鼠復(fù)制成功，為苗醫(yī)“石弱骨虛”證的研究復(fù)制了可以借鑒的實驗動物模型。

實驗給予藥物干預(yù)后結(jié)果顯示，血清中E2、Ca2+、P、25(OH)D3、1，25(OH)2D3、BGP和ALP的含量升高，說明淫羊藿可通過改變與骨形成、骨吸收、骨礦化密切相關(guān)重要生化指標，進而通過提高成骨細胞的活性、促進骨形成、增加骨礦化、增加骨量、穩(wěn)定骨礦化速率、促進血鈣、磷平衡、改善骨組織健康狀態(tài)等方式增加大鼠脛骨和股骨的重量，以此來改善大鼠“石弱骨虛”的狀態(tài)。因此，淫羊藿作為苗醫(yī)臨床常用于治療“石弱骨虛”的藥物，具有藥理學(xué)基礎(chǔ)，與其提高大鼠脛骨和股骨的重量、升高大鼠血清中E2、Ca2+、P、25(OH)D3、1,25(OH)2D3、BGP和ALP的含量有關(guān)，同時從“以藥測證”的角度來看，進一步證明本研究所復(fù)制的實驗動物模型具有一定的臨床依據(jù)。

本研究基本上復(fù)制了符合苗醫(yī)“石弱骨虛”的疾病動物模型，并采用苗醫(yī)常用的“補火藥”淫羊藿進行了模型的初步驗證，為復(fù)制適合苗醫(yī)藥研究的疾病動物模型進行了有益的探索，但更深入的研究和更多的驗證仍需繼續(xù)研究。