張夢潔 郭垚輝 任 彬 魏雅馨 崔 佳 沈 娟 楊彥玲 劉敏麗

延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的致殘性疾病，由于外力直接或間接作用于脊髓引起其結構與功能損害，造成損傷平面以下脊髓神經(jīng)功能障礙。在原發(fā)損傷的基礎上，又會出現(xiàn)一系列復雜的病理生理變化，包括局部缺血缺氧、水腫、炎癥反應、電解質改變、自由基產(chǎn)生、谷氨酸和天門冬氨酸等興奮性氨基酸的釋放及脂質過氧化等一系列病理過程[1-2]。乙酰左旋肉堿(acetyl-L-carnitine，ALC)是存在于體內的一種左旋肉堿的酯化產(chǎn)物，可穿過血腦屏障[3]。研究表明ALC可提高組織超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二酸(MDA)含量，增強抗氧化應激能力[4-6]，在脊髓損傷后乙酰左旋肉堿治療可以改善線粒體功能，與顯著的組織保留和功能恢復相關[7-8]。本實驗旨在研究 ALC 對急性脊髓損傷后大鼠運動功能恢復的影響和神經(jīng)元細胞形態(tài)、線粒體形態(tài)恢復的影響，為深入研究脊髓損傷后乙酰左旋肉堿對損傷脊髓的保護機制奠定理論基礎。

1 材料和方法

1．1實驗動物和主要儀器試劑SPF級SD大鼠72只，體質量(160±180 g)，雌性。購于西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室，許可證號：SCXK(陜)2017-003。實驗前將動物置于每天12 h∶12 h(光照∶避光)、安靜、清潔、溫度(20～22 ℃)、濕度45%～55%的實驗動物房內適應性飼養(yǎng)2周，自由攝入食物、水。所有實驗過程均經(jīng)延安大學醫(yī)學院實驗動物管理倫理委員會批準進行。ALC(Sigma-Aldrich)、HI-0400脊髓打擊器(美國PSI公司)、石蠟切片機2245(湖北徠克醫(yī)療)。多聚甲醛：天津化學試劑廠。蘇木素伊紅染液：溫州康泰生物科技有限公司。

1．2改良Allen’s法大鼠SCI模型制備大鼠術前6 h禁食、水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉。以T10 棘突為中心作常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。沿脊柱方向作一2 cm 切口，逐層切開、分離組織，微型鉗咬除T10棘突及椎板，暴露硬脊膜。固定大鼠于 HI-0400 脊髓打擊器上，充分暴露脊髓 T10節(jié)段。打擊力度 200 kdyn/cm2，致傷后大鼠隨即出現(xiàn)雙下肢、軀體撲動、強直，鼠尾擺動樣表現(xiàn)，脊髓打擊處迅速充血水腫。傷口逐層縫合，嚴格無菌操作。大鼠清醒后出現(xiàn)雙后肢運動功能障礙，視為造模成功。

1．3大鼠分組給藥及術后護理大鼠隨機分為3組：脊髓損傷組(SCI 組) 、乙酰左旋肉堿組(SCI+ALC 組)、假手術組(Sham 組)，每組22只。

Sham組大鼠不打擊脊髓，只進行椎板去除術，然后逐層縫合切口。ALC組在脊髓損傷模型建立后30 min腹腔注射給藥乙酰左旋肉堿200 mg/kg，之后每天同一時間點給藥1次，持續(xù)7 d。7 d 后每周給藥1 次；持續(xù)至第 5 周；Sham組和SCI組相同時間點、相同體積生理鹽水對照。大鼠術后單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在18～22 ℃，保持飼養(yǎng)籠內清潔、干燥，飲食不限量。術后連續(xù)3 d皮下注射50 000 U/支青霉素，1次/d。手術傷口消毒；擠壓膀胱輔助排尿早中晚3次，直至膀胱功能恢復。過程中動物缺失立即相同條件下予以補齊。

1．4大鼠后肢運動評分及行為學觀察術前2 d起分別由2名獨立觀察者(熟悉評分標準但非本組的實驗人員)采用雙盲法，將動物分別放置于直徑為2 m的圓形平臺上觀察4 min，記錄其后肢運動情況，采用BBB評分法[9]。并分別于術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d對雙后肢運動功能評分，每只大鼠的后肢體運動功能得分取2人評分平均值。

1．5灌流及取材分別于各組大鼠術后1、3 d，每組取3只，常規(guī)麻醉。大鼠取仰臥位，開胸后右心耳采血3 mL，3 000 r/min離心10 min后取血清置于 -20 ℃冰箱內保存。左心尖插入灌注針向上伸至升主動脈，動脈夾固定。4 ℃無菌生理鹽水快速灌注至肝臟發(fā)白及右心耳流出液無色透明液體后，用4%多聚甲醛灌注至大鼠軀體僵硬。置于冰上解剖脊椎，以打擊脊髓處為中點上下各取1.5 cm脊髓組織后進行外固定。乙醇梯度脫水后石蠟包埋，做5 μm厚切片，用于組織切片染色，蘇木素-伊紅染色后觀察病理組織變化情況。

1．6透射電鏡觀察每組分別取3只大鼠于術后24 h心臟灌流取大鼠打擊部分脊髓組織，包埋切片染色，用日本生產(chǎn)JEM1200型透射電鏡觀察。

每組分別取3只大鼠于脊髓損傷術后24 h，斷頭急性處死，冰上操作取脊髓組織修成1 mm×1 mm長條形，立即投于4 ℃預冷的2.5%戊二醛固定液。后續(xù)經(jīng)過脫水、滲透、包埋聚合、切片、染色，透色電鏡觀察。

2 結果

術后護理過程中死亡4只，其中SCI組3只，藥物組1只，在與之前造模相同條件下予以補充。

2．1BBB評分結果損傷前各組大鼠運動功能正常。損傷后1～3 d，SCI組和SCI+ALC組后肢運動功能恢復無明顯區(qū)別。與Sham組相比，脊髓損傷組與乙酰左旋肉堿組大鼠后肢BBB評分明顯降低(P<0.05)。損傷后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d乙酰左旋肉堿組評分均高于SCI組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。與Sham組相比，脊髓損傷組大鼠后肢BBB評分明顯降低(P<0.05)；乙酰左旋肉堿組大鼠術后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d BBB評分均高于脊髓損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2．2HE染色結果脊髓損傷后，打擊處出現(xiàn)空洞，神經(jīng)元壞死，神經(jīng)纖維脫髓鞘，急性炎性細胞浸潤。光鏡下觀察染色切片，Sham組第1天、第3天脊髓灰白質交界清楚，無出血及水腫灶，神經(jīng)元豐富，細胞核結構完整，核仁清晰可見，無核固縮及壞死現(xiàn)象(圖2A、D)。SCI組損傷后1 d，神經(jīng)元內尼氏小體模糊，空洞周圍神經(jīng)元水腫變性，出血、炎性細胞浸潤(圖2B)。SCI組損傷后3 d，神經(jīng)元死亡，有小膠質細胞圍繞(圖2E)。SCI+ALC組損傷后1 d，空洞周圍神經(jīng)元變性明顯(圖2C)。損傷后3 d，變性的神經(jīng)元有好轉，部分細胞結構逐漸清楚(圖2F)。

2．3透射電鏡觀察結果手術后24 h電鏡下觀察，Sham組線粒體線粒體呈橢圓形，嵴與長軸平行或垂直，排列清楚。SCI組線粒體腫脹，呈橢圓形、不規(guī)則形或呈啞鈴狀，線粒體嵴碎裂，有空泡化，含量較少。

SCI+ALC組神經(jīng)元細胞核結構清楚，核膜完整。胞漿內線粒體含量較多且結構完整，線粒體空泡化也較損傷組減輕。見圖3。

圖1 各組大鼠35 d的BBB評分變化 與SCI組相比，*P<0.05Figure 1 Changes in BBB scores of rats in each group at 35 days compared with SCI group，*P<0.05

表1 大鼠SCI后BBB評分 (分，

A：Sham組第1天；B：SCI組術后第1天；C：SCI+ALC組術后第1天；D：Sham組第3天；E：SCI組術后第3天；F：SCI+ALC組術后第3天圖2 術后1～3天各組脊髓組織的HE染色(光鏡10×40倍)Figure 2 HE staining of spinal cord tissues in each group 1-3 days after surgery(10×40 times)

圖3 脊髓損傷后各組線粒體形態(tài)學觀察(電鏡×8 000) A：Sham組；B：SCI組；C：SCI+ALC組Figure 3 EM showing mitochondrial morphology after SCI(×8 000)．A：Sham group；B：SCI group；C：SCI+ALC group

3 討論

隨著社會經(jīng)濟水平的發(fā)展，脊髓損傷發(fā)生率呈逐年增高的趨勢[10]。創(chuàng)傷性脊髓損傷(SCI)對患者及其家屬的身體、經(jīng)濟和社會心理健康均具有破壞性的影響。由于SCI獨特的病理生理學特征，即最初的創(chuàng)傷性損傷(原發(fā)損傷)之后是繼發(fā)的進行性損傷級聯(lián)，其特征是缺血、促凋亡信號傳導和周圍炎性細胞浸潤[11-12]。

隨著促炎細胞因子和細胞毒性碎片(DNA、ATP、活性氧)的釋放循環(huán)增加了損傷后的微環(huán)境[13]。病變發(fā)展到慢性期，周圍的星形膠質纖維瘢痕的形成嚴重阻礙了神經(jīng)組織的再生[14]。因此在脊髓損傷后早期，探究可能的干預措施對長期的功能恢復產(chǎn)生較大的影響。

線粒體作為細胞內一種高效的細胞器，其結構功能的正常是細胞進行氧化磷酸化、生成三磷酸腺苷的物質保障[15]。乙酰左旋肉堿(ALC)是左旋肉堿(L-Carnitine，LC)的主要乙酰酯，作為乙?；墓w，在β-氧化過程中促進脂肪酸從細胞質轉移到線粒體[16-17]。同時，ALC還具有抗氧化和抗凋亡作用，且對線粒體代謝有積極的作用[18]。急性脊髓損傷后，線粒體通過多種途徑參與神經(jīng)損傷，其中，氧化應激是導致神經(jīng)細胞凋亡和脊髓功能障礙的重要原因之一，如果能抑制氧化應激反應將有效促進脊髓損傷的恢復。線粒體形態(tài)學的改變提示急性脊髓損傷后的線粒體功能的變化，MEYER等[19]發(fā)現(xiàn)線粒體在急性脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷中起重要作用。另有研究表明[20]，SCI后線粒體形態(tài)不規(guī)則，體積增大。線粒體嵴紊亂，損傷后2～24 h可見線粒體膜破裂。在繼發(fā)性損傷中，線粒體功能的喪失會引起細胞死亡級聯(lián)[21-23]，且有缺陷的線粒體不僅導致生物能量效率低下的細胞，而且還增加了ROS的生成，從而進一步導致組織氧化應激。而ALC能促進谷胱甘肽的生成從而促進活性氧清除酶的生成，保護線粒體酶免受氧化損傷。在氧化磷酸化過程中，ALC與長鏈脂肪酸通過線粒體內膜的運輸密切相關。因此線粒體在維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)、細胞內信號傳導、細胞器之間的聯(lián)系、氧自由基的生成以及介導細胞凋亡中起重要作用[23-24]。

本實驗在急性脊髓損傷后應用ALC，通過行為學縱橫時間點的觀察發(fā)現(xiàn)，損傷發(fā)生后，大鼠后肢癱瘓，運動功能喪失。隨著損傷后時間的延長，后肢的運動功能逐漸恢復。相同時間點不同組別的比較發(fā)現(xiàn)，乙酰左旋肉堿可以提高急性脊髓損傷后大鼠后肢運動功能的恢復。這種療效可能與乙酰左旋肉堿減輕了神經(jīng)細胞和組織的損傷，促進了神經(jīng)運動功能恢復的組織學基礎相關。ALC作用后觀察脊髓損傷部位的形態(tài)學，發(fā)現(xiàn)變性水腫的神經(jīng)元結構逐漸清楚，細胞核清晰可見。進一步探究神經(jīng)元胞體中線粒體結構的變化發(fā)現(xiàn)，損傷后24 h SCI組線粒體腫脹，呈橢圓形、不規(guī)則形或呈啞鈴狀，線粒體嵴碎裂，有空泡化，數(shù)目減少。應用ALC的治療組，線粒體空泡化也較損傷組減輕，線粒體結構開始趨向完整。說明乙酰左旋肉堿能夠減輕SCI后的繼發(fā)性損傷，促進神經(jīng)功能的恢復[25-26]。ALC通過對SCI后對線粒體的保護從而減輕繼發(fā)性損傷給機體帶來的危害，其機制可能與通過維持損傷后的線粒體穩(wěn)態(tài)抑制神經(jīng)元凋亡，促進了脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復有關。為進一步研究ALC對線粒體的保護機制奠定了理論基礎。

志謝本研究及學術論文是在我的導師劉敏麗副教授的親切關懷和悉心指導下完成