周佳明 浦延鵬

1)葫蘆島市中心醫(yī)院，遼寧 葫蘆島 125003 2)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000

腦卒中是困擾全世界的疾病之一，近年來(lái)因腦卒中死亡的人數(shù)已上升到致死性疾病的首位，同時(shí)其也是造成病人殘疾的第一大致病原因[1]，缺血性腦卒中發(fā)病率約占77.8%，且治療方法有限[2]，大多以溶栓、抗凝等為主，很多西藥都具有不同的時(shí)效性及不良反應(yīng)，相比較而言，中醫(yī)中藥在腦卒中的治療上，因臨床效果顯著，無(wú)不良反應(yīng)等特點(diǎn)，而被絕大多數(shù)患者認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于臨床。大腦組織在缺血再灌注后很容易發(fā)生損傷，已有相關(guān)文獻(xiàn)表明[3-6]這種損傷多與線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元細(xì)胞的自噬與凋亡、BBB的滲透性等有關(guān)。LEE 等[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血性損傷后，給予肉桂的提取物治療后，能明顯減少腦梗死的面積，改善神經(jīng)細(xì)胞的損傷，所以如何有效改善腦缺血再灌注后的組織損傷成為了治療的突破口，也是眾多學(xué)者們研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，而“自噬”在則此種腦組織損傷過(guò)程中，扮演了重要的角色，它對(duì)于腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的“生存”與“滅亡”影響甚重，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出[8]，中藥單體及復(fù)方能有效減小組織缺血再灌注后壞死的面積，并能夠改善相應(yīng)臟器的功能障礙，其治療機(jī)制可能與自噬作用的調(diào)控有關(guān)。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)針對(duì)于腦梗死疾病治療的中藥藥物種類有很多，其中的桂枝、肉桂也是治療腦梗死的常用藥，主要取其溫經(jīng)通脈的功用，其中桂枝氣薄，走而不守，溫通之力強(qiáng)，可解表散寒、化瘀通痹；而肉桂氣厚，守而不走，溫補(bǔ)之力強(qiáng)，善溫補(bǔ)脾腎，溫陽(yáng)通痹；而肉桂醛[9-10](CA)(桂皮醛)就是從桂皮中提取的天然產(chǎn)物，CA的性狀呈黃色黏性液體，是樟科植物肉桂揮發(fā)油的主要成分，肉桂醛作為一種天然活性成分，具有降血糖、抗病毒和解熱鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，常用于作治療血液循環(huán)障礙類疾病，疼痛及消化不良等方面[11-14]；此外因其還具有抗氧化和抗炎的特性，所以不少學(xué)者將其用于改善大鼠心、腦、腎等臟器的缺血性再灌注損傷的治療，BAE等[15]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肉桂醛對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制神經(jīng)元的死亡及細(xì)胞自噬，并且與下調(diào)P62蛋白的表達(dá)有關(guān)。而本研究主要針對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷機(jī)制的探析，針對(duì)肉桂醛的具體作用機(jī)制是否與自噬相關(guān)，尚未有相關(guān)文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道，于是此次研究將通過(guò)中藥單體肉桂醛干預(yù)治療大鼠腦缺血再灌注損傷，觀察其對(duì)大鼠腦組織血流量和自噬作用的影響，探析其對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選擇SPF級(jí)健康成年的雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量為(280±20)g，購(gòu)買(mǎi)于錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證編號(hào)：SCXK[遼]2014-0004)。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d時(shí)間，動(dòng)物室溫度保持在(20±2)℃，濕度保持在45%左右，每12 h晝夜交替，給予大鼠自由飲水，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，每2～3 d更換1次墊料。采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、肉桂醛高劑量組、3-MA組、肉桂醛低劑量組，每組各10只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理均遵照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》中相關(guān)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1．2主要試劑與儀器組織自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，石蠟切片機(jī)(萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司)，顯微鏡(尼康儀器有限公司，日本)，電泳儀及發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，激光多普勒血流儀(moor，英國(guó))，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)。SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、超敏ECL試劑盒、β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、beclin-1(萬(wàn)類生物)，LC3II抗體、p62抗體(proteintech公司)，3-Methyladenine (3-MA，T1897，50mg)購(gòu)自Targetmol公司；二甲苯、無(wú)水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)，甲酚紫(索萊寶)，冰醋酸(西亞試劑)。

1．3模型制備方法采用改良線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。將SD大鼠麻醉后，用橡皮筋綁住四肢，仰臥位固定于木板自制的手術(shù)臺(tái)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，于遠(yuǎn)心端將頸內(nèi)動(dòng)脈剪個(gè)“V”型口，將磨圓滑的魚(yú)線插入2 cm，然后將魚(yú)線和頸內(nèi)動(dòng)脈一起結(jié)扎。1.5 h后將魚(yú)線拔出，縫合皮膚。待大鼠清醒后對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評(píng)分，參照Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[16]進(jìn)行評(píng)分，將評(píng)分為1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，未達(dá)標(biāo)者排除。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中2只大鼠死亡，隨機(jī)補(bǔ)充。假手術(shù)組術(shù)式同上，但魚(yú)線插入深度為0.5～1 cm。

1．4干預(yù)方法肉桂醛組大鼠分別給予腹腔注射肉桂醛75 mg/(kg·d)和25 mg/(kg·d)治療，根據(jù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究選擇肉桂醛的治療劑量[17]，3-MA組：于造模前1 h腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，造模成功后與假手術(shù)組和模型組一起，每天腹腔注射與高劑量肉桂醛組相同劑量的生理鹽水，共治療7 d。

1．5指標(biāo)測(cè)定

1．5．1 各組大鼠治療前后神經(jīng)缺損評(píng)分變化：參照LONGA等[16]評(píng)價(jià)方法，對(duì)各組大鼠在治療前后分別行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，并作比較。

1．5．2 大鼠腦血流速度檢測(cè)：治療7 d后，用一次性注射器將20%烏拉坦(5 mL/kg)，由腹腔注入，以麻醉大鼠，然后將其固定在ST-3ND型定位儀上，暴露出顱骨冠狀縫和矢狀縫，取冠狀縫下3 cm，矢狀縫右旁開(kāi)2 cm處骨鉆，打開(kāi)硬質(zhì)骨及硬腦膜，暴露軟腦膜，開(kāi)顱出直徑約1 cm的“窗口”。將激光多普勒血流儀探針頭固定在支架上，讓探頭以均等力度接觸到軟腦膜上，然后用計(jì)算機(jī)連續(xù)記錄血流量及血流速度。

1．5．3 尼氏染色：于治療干預(yù)7 d后，各組隨機(jī)抽取3只大鼠腹腔麻醉，迅速斷頭取腦置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后進(jìn)行切片，然后用1%焦油紫或1%硫堇染色1 h。蒸餾水清洗，70%酒精分色數(shù)秒至數(shù)分鐘，依次經(jīng)70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2 min脫水，無(wú)水乙醇2次，每次5 min。二甲苯2次，每次10 min，然后脫水透明封片，用拍照顯微鏡對(duì)大鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)缺血區(qū)進(jìn)行拍照觀察計(jì)數(shù)，尼氏體呈紫色、細(xì)胞核呈淡紫色。

1．5．4 Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3II、P62的表達(dá)：在各組大鼠再灌注7 d后，隨機(jī)選取3只腹腔麻醉，迅速斷頭取腦，取皮層缺血區(qū)腦組織制備蛋白樣本，用BCA法檢定量各樣本組蛋白，采用12%的SDS-PAGE凝膠，取30 μg蛋白樣品，電泳后采用0.22 μm的PVDF膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印，電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后一抗(1∶500)于4 ℃搖床里孵育過(guò)夜，用TBST洗膜3次(10 min/次)后將PVDF膜封入二抗稀釋液(1∶2 000)中，室溫?fù)u床孵育2 h，再用TBST洗膜3次(10 min/次)后在PVDF膜上滴加ECL顯影液，以化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)曝光成像，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin作為內(nèi)參，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2．1各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的表現(xiàn)，而模型組大鼠則出現(xiàn)不同的神經(jīng)功能障礙。7 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，肉桂醛高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分下降明顯，抑制劑組評(píng)分亦下降，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 1 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．2各組大鼠腦組織血流的變化各組大鼠7 d后大腦皮質(zhì)組織血流量變化如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦血流量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較：肉桂醛高劑量組和3-MA組血流量及速度均明顯增加(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注后7 d大腦皮質(zhì)血流量的影響及速度 與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 2 The influence and velocity of cerebral cortex blood flow 7 days after cerebral ischemia reperfusion in each group of rats．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

2．3各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)尼氏染色比較尼氏小體是神經(jīng)元體內(nèi)嗜堿性顆粒，當(dāng)神經(jīng)元功能正常時(shí)，其結(jié)構(gòu)較固定，當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏小體會(huì)減少甚至溶解，因此可通過(guò)尼氏染色觀察尼氏小體的狀態(tài)判斷腦組織缺血側(cè)神經(jīng)損傷的情況，通過(guò)鏡下觀察發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞尼氏小體(呈紫色、細(xì)胞核呈淡紫色)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞呈多角形，模型組可見(jiàn)尼氏小體數(shù)量減少，肉桂醛高劑量組和3-MA組尼氏小體的數(shù)量較模型組多(P<0.01)。見(jiàn)圖3、4。

注：1(假手術(shù))、2(模型組)、3(肉桂醛高劑量組)、4(3-MA組)、5(肉桂醛低劑量組)×200倍鏡下拍照，標(biāo)尺=100 μm

2．4各組大鼠缺血側(cè)腦組織自噬相關(guān)蛋白beclin1、LC3II、P62的表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組beclin1和LC3II蛋白表達(dá)水平升高，而p62表達(dá)水平降低(**P<0.05)，與模型組比較，肉桂醛高劑量組和3-MA組beclin1、LC3II蛋白表達(dá)水平明顯減少，而p62的表達(dá)水平明顯增多(##P<0.05)。

圖4 各組尼氏體數(shù)量比較 與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01Figure 4 Comparison of the number of Nissl bodies in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

圖5 各組大鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與假手術(shù)比較，**P<0.05；與模型組比較，##P<0.05Figure 5 The expression of autophagy-related proteins in the brain tissue of rats in each group．Compared with the sham operation group，**P<0.01；compared with the model group，##P<0.01

3 討論

隨著時(shí)代的發(fā)展，生活水平的不斷提高，人們不良的生活及飲食習(xí)慣亦日漸增多，與此同時(shí)，如高血脂、高血壓、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病亦呈增高的趨勢(shì)，由此類基礎(chǔ)疾病所導(dǎo)致的患者腦梗死發(fā)病率也逐年升高，嚴(yán)重威脅人類的健康，又因該病具有高致殘率和病死率的特點(diǎn)，遂被專家、學(xué)者們持續(xù)的關(guān)注和研究[17-18]。近期有相關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[19]，腦缺血再灌注所致的神經(jīng)功能損傷及細(xì)胞凋亡與自噬密切相關(guān)，當(dāng)發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，機(jī)體會(huì)發(fā)動(dòng)自噬作用來(lái)清除受損的細(xì)胞器，以發(fā)揮腦保護(hù)作用；因自噬作用是一種自我降解和清除的動(dòng)態(tài)過(guò)程，當(dāng)機(jī)體受到外界的刺激導(dǎo)致細(xì)胞器受損時(shí)，就會(huì)激活自噬作用以降解受損細(xì)胞器和清除蛋白質(zhì)[20]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱中藥可以抑制神經(jīng)元的過(guò)度自噬而改善缺血再灌注后相應(yīng)臟器功能的恢復(fù)[10]，而“自噬”作為腦缺血再灌注損傷中重要的病理變化之一，現(xiàn)已經(jīng)成為學(xué)者們探究的熱點(diǎn)內(nèi)容[21-22]，自噬主要分為三大類型：微自噬、巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬，而巨自噬就是通常所說(shuō)的“自噬”，主要過(guò)程為誘導(dǎo)自噬、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合及內(nèi)容物降解。在整個(gè)自噬作用的過(guò)程中，LC3II是生成自噬體膜的必備物質(zhì)，是自噬體形成的最重要分子[23]；而P62作為自噬底物蛋白，憑借在C端與泛素化蛋白結(jié)合，和在N端與LC3-Ⅱ相結(jié)合，參與整個(gè)自噬的降解[24]。因此，我們選用LC3II和P62兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)來(lái)反映自噬作用。此外在自噬體形成的初始階段，Beclin1與Ⅲ型PI3K、p150結(jié)合形成Ⅲ型PI3K復(fù)合體，作為該復(fù)合物的中心蛋白，主要發(fā)揮促使自噬體成熟的作用[25]，然后Beclin1還能與Atg1及Atg9一同作用，共同參與調(diào)控吞噬泡的形成，最終促進(jìn)自噬的發(fā)生[26]，所以本次研究選擇檢測(cè)LC3II、Beclin1和P62的表達(dá)來(lái)指示自噬通量。而3-MA則是針對(duì)自噬作用常用的一種抑制劑，廣泛用于自噬誘導(dǎo)的研究中，因此我們選用3-MA作為陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)比較和探究肉桂醛對(duì)腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織的保護(hù)作用是否與自噬作用相關(guān)。

本次研究主要觀察肉桂醛對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的治療作用，通過(guò)藥物治療干預(yù)后，分析大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦血流的改變以及腦組織尼氏染色和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終得出這樣的結(jié)果，大鼠腦缺血再灌注損傷在肉桂醛進(jìn)行治療干預(yù)后，大鼠的神經(jīng)功能得到明顯改善，于此同時(shí)與模型組比較，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3II蛋白表達(dá)水平明顯減少，而P62的表達(dá)水平明顯增多，說(shuō)明自噬作用被抑制，由此可以得出這樣的推論，肉桂醛能夠改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的神經(jīng)功能，且高劑量組效果最為顯著，其具體的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制自噬作用而發(fā)揮療效的。