潘璧瑩，魏均曼，夏覓真，吳琳梅

(安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

粘土礦物(如蒙脫石、高嶺石和海泡石等)是層狀含水鋁硅酸鹽礦物，作為一種天然的納米材料，其有大比表面積，豐富孔隙率，良好吸附性能，較高吸附容量和離子交換能力。因而，可作為多種藥物的載體材料，具有載藥容量高，緩釋性能好等特點(diǎn)[1-2]。雖然將藥物負(fù)載到粘土礦物基納米材料上展現(xiàn)出了眾多優(yōu)勢(shì)，但是納米材料由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，如大的比表面積和高的吸附活性，很容易和生命體系中的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，在納米材料表面形成蛋白質(zhì)冠，這層蛋白冠的形成不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)分子本身的結(jié)構(gòu)和生物功能，也可能會(huì)改變納米材料的生物學(xué)行為、藥物釋放和藥效情況[3-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以蒙脫石為模型粘土礦物，5-氟尿嘧啶(抗癌藥物)為模型藥物，制備5-氟尿嘧啶/蒙脫石(5-Fu/Mt)緩釋藥物；以BSA為模型蛋白質(zhì)，考察BSA濃度、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)藥物釋放的影響；并采用肺癌A549細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，觀察BSA存在情況下5-Fu/Mt緩釋藥物對(duì)細(xì)胞增殖情況的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑和儀器：蒙脫石與5-氟尿嘧啶由上海麥克林生化科技有限公司提供；肺癌A549細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供；牛血清白蛋白BSA、1640培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、透析袋(分子量8000～14000)、考馬斯亮藍(lán)等試劑均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；UV-5200紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；酶標(biāo)儀(Infinite M200, Tecan, Austria)。

1.2 5-Fu/Mt緩釋藥物的制備

燒杯中加入50 mL NaOH，2 g Mt與0.4 g 5-Fu，并在加熱至80 ℃的油浴鍋中攪拌4 h，去離子水洗滌，離心過(guò)濾取上清，在265 nm處測(cè)定其平均吸光度。沉淀干燥，研磨得到5-Fu/Mt緩釋藥物[7]。緩釋藥物中5-Fu的含量通過(guò)吸附前后溶液吸光度的變化，對(duì)照5-Fu標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算得出。

1.3 BSA分子的吸附

用50 mL 0.01 mol/L pH=7.4的PBS緩沖液配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL 的BSA溶液，并向其中分別加入200 mg上述方法制備的5-Fu/Mt，于37 ℃條件吸附一定時(shí)間(1 h、2 h、4 h、6 h、10 h、16 h、24 h)。而后，取出離心，取上清液利用考馬斯亮藍(lán)在595 nm測(cè)蛋白質(zhì)的吸光度，并計(jì)算蛋白質(zhì)吸附量。蛋白質(zhì)吸附量Qe=[(C0-Ce)×V]/m，Qe為5-Fu/Mt藥物對(duì)BSA的吸附量，mg/g；C0為吸附前BSA溶液的濃度，mg/mL；Ce為吸附平衡后溶液中BSA的濃度，mg/mL；V為BSA溶液的體積，mL；m為5-Fu/Mt藥物的加入量，g。

1.4 藥物體外釋放

用PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)緩沖液配置0.2 mg/mL與1 mg/mL的BSA溶液。實(shí)驗(yàn)組：透析袋中加入200 mg 5-Fu/Mt 及 5 mL上述BSA溶液；對(duì)照組：透析袋中加入200 mg 5-Fu/Mt及5 mL PBS溶液。將以上透析袋放入裝有100 mL PBS的燒杯中，37 ℃水浴下反應(yīng)。分別于反應(yīng)10 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后從燒杯中取樣5 mL，并將事先預(yù)熱好的5 mL PBS加入補(bǔ)充。取樣液體經(jīng)過(guò)濾后，測(cè)其265 nm處吸光度，計(jì)算累計(jì)釋放量(Er)[8]。

式中：Er為5-Fu的累積釋放量，%；Ve為釋放介質(zhì)置換體積，mL；V0為起始釋放液體積，mL；pi為第i次置換時(shí)，釋放液中藥物濃度，mg/mL；n為置換釋放介質(zhì)的次數(shù)；mdrug為起始5-Fu/Mt藥物的質(zhì)量，mg。載藥量(D)=蒙脫石所載藥物(5-Fu)質(zhì)量/蒙脫石載藥復(fù)合物(5-Fu/Mt)質(zhì)量×100%。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

取肺癌A549細(xì)胞在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)(5% CO2，37 ℃)。細(xì)胞每2天進(jìn)行傳代和換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞開(kāi)展各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.6 MTT檢測(cè)

處于對(duì)數(shù)期的肺腺癌A549細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)調(diào)整細(xì)胞濃度為3.3×104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔150 μL，于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，每個(gè)孔用PBS清洗兩遍。5-Fu/Mt使用前于15 mL離心管中高壓蒸汽滅菌(121 ℃，25 min)。

(1)無(wú)BSA時(shí)5-Fu/Mt對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響：PBS清洗后，96孔板中分別加入150 μL不同濃度的5-Fu/Mt懸液(10、30、50、100、250、500 μg/mL，無(wú)血清1640培養(yǎng)基配制)；(2)BSA存在條件下5-Fu/Mt對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響：分別用25、50、100、200、400 μg/mL的BSA溶液(無(wú)血清1640培養(yǎng)基配制，過(guò)濾滅菌)為溶劑，配制濃度為30 μg/mL的5-Fu/Mt懸液。PBS清洗后，96孔板中分別加入上述配制的5-Fu/Mt懸液150 μL。為消除5-Fu/Mt對(duì)吸光度的影響，設(shè)置空白對(duì)照組，僅加入150 μL的5-Fu/Mt懸液不接種細(xì)胞；陰性對(duì)照組則是在含細(xì)胞孔中僅加入150 μL的無(wú)血清1640培養(yǎng)基；調(diào)零孔只加入同體積無(wú)血清的1640培養(yǎng)基不接種細(xì)胞。

按照上述方法孵育24 h后，棄上清，每孔中加入5 mg/mL MTT試劑20 μL，繼續(xù)孵育4 h，而后棄MTT試劑，加入200 μL DMSO，震蕩處理5 min，保證結(jié)晶充分溶解，經(jīng)酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定每孔的OD值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)應(yīng)空白組OD值)/(陰性對(duì)照OD值-調(diào)零孔OD值)×100%，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)比采取t檢驗(yàn)，在P<0.05時(shí)，視為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 5-Fu/Mt緩釋藥物對(duì)BSA的吸附

圖1a為在pH=7.4，37 ℃，吸附24 h條件下，5-Fu/Mt藥物對(duì)BSA的吸附等溫線。結(jié)果表明：BSA在5-Fu/Mt緩釋藥物上吸附等溫線形狀呈S型。S型吸附等溫線是常見(jiàn)的等溫線，以表面吸附為主[9]。吸附等溫線中，平衡濃度升高時(shí)吸附量平緩變化部分表示固體表面已經(jīng)被溶質(zhì)單層飽和；濃度再增加，吸附量再增大，可能是溶質(zhì)分子發(fā)生了多層吸附或者溶質(zhì)分子形成更密集地排列。圖1b顯示，在吸附開(kāi)始階段，BSA快速吸附到5-Fu/Mt表面，并在4 h達(dá)到吸附極值。而后，隨著吸附的進(jìn)行，BSA脫附速率大于吸附速率，部分吸附的蛋白質(zhì)重新回到溶液中，吸附量減小，并在吸附10 h后，達(dá)到平衡，使得5-Fu/Mt表面的BSA吸附量基本保持恒定。蒙脫石對(duì)蛋白質(zhì)或氨基酸的吸附主要是通過(guò)蒙脫石表面電荷與蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸引完成[10-11]。蒙脫石為2：1型層狀硅酸鹽礦物，表面電荷以永久負(fù)電荷為主。BSA分子的等電點(diǎn)為4.8，吸附在pH=7.4的PBS緩沖液中進(jìn)行，因此BSA分子所帶的負(fù)電荷增加，BSA分子和蒙脫石之間的靜電引力減弱，隨著吸附時(shí)間的增加，BSA分子容易從蒙脫石表面脫附出來(lái)[12-14]，造成BSA吸附量減小。

圖1 5-Fu/Mt緩釋藥物對(duì)BSA吸附等溫線(a)及時(shí)間對(duì)BSA(1 mg/mL)吸附量的影響(b)

2.2 BSA對(duì)5-Fu/Mt藥物體外緩釋的影響

BSA對(duì)5-Fu/Mt藥物體外釋放的影響如圖2所示：0～4 h階段，BSA的存在明顯抑制了5-Fu的釋放，且BSA的濃度越大，抑制程度越大；4～12 h階段，BSA對(duì)5-Fu釋放的抑制作用減弱，低濃度BSA(0.2 mg/mL)存在時(shí)5-Fu的釋放量與對(duì)照組(0 mg/mL BSA)幾乎相等。結(jié)合BSA的吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(圖1b)推測(cè)造成這一現(xiàn)象的原因可能是：BSA分子在0～4 h內(nèi)大量吸附到5-Fu/Mt表面，與5-Fu發(fā)生相互作用，從而影響其從Mt載體中釋放，且BSA的濃度越大，吸附量越多(圖1a)，抑制作用越明顯；4 h后，由于大量吸附的BSA從5-Fu/Mt上脫附出來(lái)，因此BSA對(duì)5-Fu釋放的抑制作用減弱。

利用DDSolver軟件對(duì)5-Fu/Mt藥物在不同BSA濃度下的釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行Peppas方程(Q=Ktn)擬合，研究藥物釋放機(jī)制。式中，Q為累積釋放百分率，t為釋放時(shí)間，n為釋放機(jī)制表征參數(shù)。當(dāng)n≤0.45時(shí)，藥物的釋放機(jī)制為Fick擴(kuò)散；當(dāng)0.45

圖2 BSA濃度對(duì)5-Fu/Mt藥物體外緩釋的影響

2.3 BSA存在時(shí)5-Fu/Mt對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響

圖3 5-Fu/Mt藥物濃度作用下A549細(xì)胞的存活率

5-Fu可引起細(xì)胞的自噬或者凋亡以此來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的存活率降低[16]。當(dāng)5-Fu負(fù)載到Mt上時(shí)，其對(duì)細(xì)胞的影響如圖3所示：無(wú)BSA情況下，5-Fu/Mt對(duì)肺癌A549細(xì)胞的存活有一定的抑制作用，且5-Fu/Mt濃度越大，抑制作用愈明顯(P<0.01)。肺癌A549細(xì)胞與不同濃度(10、30、50、100、250、500 μg/mL)5-Fu/Mt藥物作用24 h后，細(xì)胞形態(tài)的變化如圖4所示：陰性對(duì)照組的肺癌A549細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多邊形或者梭形，視野下細(xì)胞數(shù)量較多。低濃度(<50 μg/mL)5-Fu/Mt藥物作用下，隨著濃度的增加，視野下細(xì)胞數(shù)量減少，并且細(xì)胞固縮變圓，體積變小，呈半貼壁狀態(tài)；然而，進(jìn)一步增大藥物濃度到100和250 μg/mL時(shí)，由于藥物濃度過(guò)大，視野下只看到懸浮在培養(yǎng)基里的5-Fu/Mt藥物，幾乎看不到細(xì)胞。由改良寇式法計(jì)算得出的半數(shù)抑制濃度(IC50)=27.67 μg/mL。綜合考慮，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，5-Fu/Mt藥物的濃度設(shè)置為30 μg/mL。

當(dāng)體系中BSA存在時(shí)，其濃度是影響5-Fu/Mt藥效的重要因素。如圖5所示：低濃度(25 μg/mL、50 μg/mL)BSA分子的加入，并未能顯著引起細(xì)胞存活率的改變(P>0.05)。但是，當(dāng)BSA濃度大于100 μg/mL時(shí)，5-Fu/Mt藥物對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用失效，細(xì)胞存活率顯著提高(P<0.01)。

圖4 無(wú)BSA存在時(shí)顯微鏡下A549的細(xì)胞形態(tài)隨5-Fu/Mt

圖5 BSA存在條件下5-Fu/Mt對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

3 結(jié) 論

5-Fu/Mt藥物能夠吸附大量的BSA分子，并在10 h后達(dá)到吸附/脫附平衡。吸附上的BSA分子影響5-Fu/Mt藥物的緩釋?zhuān)?～4 h階段，BSA顯著抑制了5-Fu的釋放，且BSA的濃度越大，抑制程度越高，4 h后由于大量吸附的BSA分子脫附出來(lái)，BSA的抑制釋放作用減弱。數(shù)據(jù)擬合結(jié)果顯示5-Fu/Mt藥物在不同BSA濃度下的釋放機(jī)制均為Fick擴(kuò)散。5-Fu/Mt對(duì)肺癌A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為27.67 μg/mL，高濃度BSA的存在減弱了5-Fu/Mt對(duì)肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。