尤旭 朱小芳 胡運(yùn)鵬 龔楊 趙磊

434000 荊州，湖北省荊州市中心醫(yī)院院前急救科

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)可由不同病因及病理機(jī)制引起，以腎功能迅速下降、腎衰竭為主要臨床特征，可導(dǎo)致多臟器、多系統(tǒng)受累而危及生命[1-2]。然而，目前對(duì)于AKI的治療仍缺乏特異性藥物[1]。銀杏內(nèi)酯是從銀杏葉中分離提取的萜內(nèi)脂類化合物，為銀杏葉提取物的主要活性物質(zhì)[3]。近年來(lái)，大量研究證明銀杏葉提取物對(duì)糖尿病腎病、腎小管上皮細(xì)胞凋亡、腎急性缺血再灌注損傷等有保護(hù)作用[4-5]，但銀杏內(nèi)酯對(duì)AKI是否有保護(hù)作用未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)廣泛表達(dá)于腎臟細(xì)胞中，可增強(qiáng)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)去乙?；钚?，抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，減輕組織炎癥損傷[6-8]，而SIRT1在腎小管上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，對(duì)不同機(jī)制誘導(dǎo)的AKI有保護(hù)作用[9-10]。本研究通過(guò)經(jīng)皮下注射慶大霉素建立AKI大鼠模型，探究銀杏內(nèi)酯對(duì)AKI大鼠的保護(hù)作用及對(duì)AMPK/SIRT1通路的影響，以期為臨床合理用藥提供參考。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.動(dòng)物 清潔級(jí)同遺傳背景SD大鼠50只，體重200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為省科委2000A027。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，噪音低于80分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。

2.主要試劑及儀器 銀杏內(nèi)酯注射液(成都百裕制藥，批號(hào)：2019090601)；慶大霉素注射液(廣州阿達(dá)拉生物科技有限公司，批號(hào)：2017090601)；HE染色試劑盒(上海生物公司，貨號(hào)E677218-0200)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(北京索萊寶生物有限公司，批號(hào)：20190301，2019050603)、IL-6和TNF-α、Scr和BUN、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎損傷因子1(KIM-1)等ELISA試劑盒(北京索萊寶生物有限公司，批號(hào)：2018122201、2019082303、2019092503、2019063003、2019052503、2019022303)；凝膠電泳遷移率轉(zhuǎn)變分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)試劑盒(美國(guó)pierce公司，貨號(hào)：AP2032)；抗體pAMPK、AMPK、SIRT1(美國(guó)Perkin Elmer公司，貨號(hào)：AP3013、AP2055、AP4016)；核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸(DNA序列：3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCGG-5′，5′-AGT TGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′)購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：2018032402)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(上海碧云天公司，貨號(hào)P0027)等。手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，型號(hào)RM2125RTS)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司，型號(hào)SMZ745)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkin Elmer公司，型號(hào)XElx800)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)1659001、Trans-Blot SD)；凝膠成像儀(Miulab公司，型號(hào)：GIS-500)等。

二、方法

1.大鼠AKI模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[11]構(gòu)建AKI模型，具體操作方法為：經(jīng)皮下注射慶大霉素，80 mg/kg，每天一次，連續(xù)6 d即可造模成功。將造模成功的40只大鼠分為AKI組和銀杏內(nèi)酯低(2.5 mg/kg)、中(5.0 mg/kg)、高(7.5 mg/kg)劑量組，每組10只，另取10只大鼠，皮下注射等劑量生理鹽水6 d作為正常對(duì)照組(Control組)。造模結(jié)束后2 h開始給藥，銀杏內(nèi)酯以生理鹽水配置為0.25 mg/mL、0.50 mg/mL、0.75 mg/mL混懸液，藥物處理組大鼠均以10 mL/kg的劑量經(jīng)腹腔注射給藥，Control組與AKI組經(jīng)腹腔注射等劑量生理鹽水，各組連續(xù)給藥14 d，1次/d。

2.腎功能檢測(cè)及標(biāo)本采集 末次給藥1 h后，收集各組大鼠尿液，并將大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后處死，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL，將尿液和血液分別在3 000 r/min,離心半徑10 cm條件下離心10 min后，取上清液，一部分上清液按ELISA試劑盒檢測(cè)方法，分別檢測(cè)腎功能指標(biāo)Scr、BUN及尿中NGAL、KIM-1含量，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行；另一部分上清液于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７謩e摘取大鼠左右兩腎，經(jīng)磷酸緩沖鹽沖洗后，迅速置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.腎組織HE染色病理學(xué)檢測(cè) 取-80 ℃保存的左腎，于4 ℃冰箱中解凍后，進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，用蘇木精-伊紅染色5 min，1%鹽酸酒精分化10 s，蒸餾水漂洗2 min，梯度酒精脫水2 min，二甲苯透明處理，中性光學(xué)樹脂封片后，置于顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)變化。

4.檢測(cè)大鼠腎臟組織SOD、MDA含量 取-80 ℃保存的右腎組織，于4 ℃冰箱中解凍后，剪碎，制備組織勻漿液，按試劑方法檢測(cè)腎臟組織SOD、MDA含量，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

5.檢測(cè)大鼠腎臟組織IL-6、TNF-α含量 取-80 ℃保存的右腎組織，于4 ℃冰箱中解凍后，剪碎，制備組織勻漿液，以ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-α含量，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

6.EMSA檢測(cè)大鼠腎臟組織NF-κB活性 取-80 ℃保存的右腎組織，于4 ℃冰箱中解凍后，嚴(yán)格按核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書方法提取腎組織核蛋白；制備生物素標(biāo)記探針，用5′端生物素標(biāo)記帶有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸并將其作為探針，將核蛋白與探針在室溫下孵育20 min，然后以6.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析其吸光度值。

7.Western blot法檢測(cè)腎組織AMPK/pAMPK、SIRT1蛋白的表達(dá) 取-80 ℃保存的右腎組織，于4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白裂解液裂解離心后提取蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度，取50 μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗AMPK、pAMPK、SIRT1、β-actin(內(nèi)參)抗體，稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000，1∶2 000，1∶1 000，1∶2 000，4 ℃搖床室溫孵育過(guò)夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組大鼠腎組織病理?yè)p傷程度觀察

Control組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯損傷。與Control組比較，AKI組大鼠可見腎小管上皮細(xì)胞脫落，空泡樣變性，腎小管管腔擴(kuò)張等病理?yè)p傷。與AKI組大鼠比較，銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組大鼠腎小管上皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象、變性及增生等病理?yè)p傷程度明顯減輕。與銀杏內(nèi)酯低劑量組比較，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組腎小管上皮細(xì)胞脫落及變性等病理?yè)p傷進(jìn)一步減輕。(圖1)

二、各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

與Control組相比，AKI組大鼠Scr和BUN、尿液中NGAL和KIM-1含量明顯升高(P<0.05)；與AKI組相比，銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組Scr和BUN、尿液中NGAL和KIM-1含量明顯降低(P<0.05)；與銀杏內(nèi)酯低劑量組相比，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組Scr和BUN、尿液中NGAL和KIM-1含量明顯降低(P<0.05)。(表1)

三、各組大鼠腎組織炎性因子IL-6、TNF-α含量比較

與Control組相比，AKI組大鼠腎組織IL-6、TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；與AKI組相比，銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組大鼠IL-6、TNF-α含量明顯降低(P<0.05)；與銀杏內(nèi)酯低劑量組相比，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組IL-6、TNF-α含量明顯降低(P<0.05)。(表2)

四、各組大鼠腎組織MDA、SOD含量比較

與Control組相比，AKI組大鼠腎組織MDA含量明顯升高(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)；與AKI組相比，銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組大鼠腎組織MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯升高(P<0.05)；與銀杏內(nèi)酯低劑量組相比，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組腎組織MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯升高(P<0.05)。(表3)

圖1 各組大鼠腎組織病理?yè)p傷圖(HE染色,400×) A.Control組;B.AKI組;C.銀杏內(nèi)酯低劑量組;D.銀杏內(nèi)酯中劑量組;E.銀杏內(nèi)酯高劑量組

五、各組大鼠腎組織pAMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)及NF-κB活性的比較

與Control組相比，AKI組大鼠p-AMPK/AMPK、SIRTl蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，NF-κB活性明顯升高(P<0.05)。與AKI組相比，銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組大鼠腎組織p-AMPK/AMPK、SIRTl蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，NF-κB活性明顯降低(P<0.05)；與銀杏內(nèi)酯低劑量組相比，銀杏內(nèi)酯中、高劑量組大鼠腎組織p-AMPK/AMPK、SIRTl蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，NF-κB活性明顯降低(P<0.05)。(圖2、圖3、圖4)

表1 各組大鼠血清Scr和BUN、尿液中NGAL和KIM-1含量比較

表2 各組大鼠腎組織IL-6、TNF-α含量比較(pg/mL)

表3 各組大鼠腎組織MDA、SOD含量比較

注：A為Control組；B為AKI組；C為銀杏內(nèi)酯低劑量組；D為銀杏內(nèi)酯中劑量組；E為銀杏內(nèi)酯高劑量組。圖2 各組大鼠腎組織pAMPK/AMPK、SIRT1蛋白免疫印跡圖

圖3 EMSA法檢測(cè)各組大鼠腎組織NF-κB活性 A.Control組;B.AKI組;C.銀杏內(nèi)酯低劑量組;D.銀杏內(nèi)酯中劑量組;E.銀杏內(nèi)酯高劑量組

注：與Control組比較，aP<0.05；與AKI組比較，bP<0.05；與銀杏內(nèi)酯低劑量組比較，cP<0.05。圖4 各組大鼠腎組織pAMPK/AMPK、SIRT1蛋白表達(dá)及NF-κB活性比較

討 論

AKI病因多樣，病死率高，發(fā)病機(jī)制不明確，是臨床常見的嚴(yán)重病癥之一[12]。臨床上評(píng)價(jià)AKI常用指標(biāo)為Scr和BUN，另外尿中NGAL和KIM-1為評(píng)價(jià)AKI早期指標(biāo)[13]。給大鼠皮下注射慶大霉素會(huì)損害腎臟，是復(fù)制AKI損傷模型的一種經(jīng)典方法[11]。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，成月英等[4]發(fā)現(xiàn)銀杏復(fù)方湯劑對(duì)兔腎缺血灌注再損傷有保護(hù)作用；李瑞杰等[5]發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對(duì)糖尿病腎損傷大鼠有保護(hù)作用；馮等[14]發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯注射液對(duì)出血性腦梗死具有較好的治療效果，故本研究推測(cè)，作為銀杏提取物主要成分的銀杏內(nèi)酯對(duì)AKI也可能具有一定的保護(hù)作用。建立模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AKI組大鼠Scr、BUN及尿NGAL、KIM-1含量比Control組升高，且HE染色顯示AKI組大鼠腎小管上皮細(xì)胞崩解脫落、空泡變性等病理?yè)p傷，提示AKI造模成功。給予銀杏內(nèi)酯治療后發(fā)現(xiàn)，相比于AKI組，銀杏內(nèi)酯高、中、低劑量組大鼠腎組織病理?yè)p傷減輕，Scr、BUN、NGAL、KIM-1含量下降，且銀杏內(nèi)酯中、高劑量組優(yōu)于低劑量組，表明銀杏內(nèi)酯可緩解腎小管上皮細(xì)胞損傷，改善腎功能，對(duì)AKI有保護(hù)作用。

大量研究表明脂質(zhì)過(guò)氧化和炎性介質(zhì)釋放是慶大霉素引起腎毒性的重要原因[15-17]。谷名曉等[17]發(fā)現(xiàn)上調(diào)SOD水平，下調(diào)MDA水平，可降低氧化應(yīng)激，緩解慶大霉素所致的AKI。宋小紅等[18]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過(guò)降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低炎癥反應(yīng)標(biāo)志物IL-6、TNF-α含量等，可改善慶大霉素所致AKI癥狀。成月英等[4]發(fā)現(xiàn)銀杏復(fù)方湯劑可減輕氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，緩解缺血再灌注導(dǎo)致的腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，AKI組大鼠腎組織中MDA、IL-6、TNF-α含量增加，SOD活性降低，提示AKI組大鼠腎組織內(nèi)存在氧化應(yīng)激和炎性損傷；與AKI組相比，銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量組大鼠腎組織中MDA、IL-6、TNF-α含量明顯降低，且銀杏內(nèi)酯中、高劑量組優(yōu)于低劑量組，表明銀杏內(nèi)酯可通過(guò)上調(diào)AKI模型大鼠腎組織中SOD活性、下調(diào)MDA含量降低氧化應(yīng)激損傷，降低炎性因子釋放緩解炎性損傷，從而達(dá)到改善慶大霉素所致的AKI。

AMPK可上調(diào)SIRT1去乙?；杆剑种芅F-κB核移位活化，影響下游氧化應(yīng)激及炎癥因子表達(dá)情況，從而調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞炎性損傷和氧化應(yīng)激水平，影響腎功能[6-8]。SIRT1被激活后，具有抗氧化、抗炎等作用，對(duì)多種原因誘導(dǎo)的AKI有保護(hù)作用[10-19]。Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)，銀杏黃酮苷元可通過(guò)上調(diào)AKI小鼠腎組織中SIRT1表達(dá)，抑制NF-κB活性，減少炎癥因子釋放，從而減輕AKI腎組織中炎癥反應(yīng)。翁思穎等[21]發(fā)現(xiàn)益氣活血湯可通過(guò)上調(diào)AMPK/SIRT1通路表達(dá)，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解高糖所導(dǎo)致腎損傷。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)，給予SIRT1激動(dòng)劑可減輕缺血-再灌注所致AKI大鼠腎組織中炎性因子釋放及氧化應(yīng)激損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，AKI組大鼠腎組織中p-AMPK/AMPK、SIRTl蛋白表達(dá)降低，NF-κB活性增高；給予銀杏內(nèi)酯低、中、高劑量治療后，與AKI組比較，各藥物處理組大鼠腎組織p-AMPK/AMPK、SIRTl蛋白表達(dá)升高，NF-κB活性降低，且中、高劑量組p-AMPK/AMPK、SIRTl蛋白表達(dá)高于低劑量組，NF-κB活性低于低劑量組，表明銀杏內(nèi)酯可能通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1通路，抑制NF-κB活化，降低AKI大鼠腎組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯可能通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1通路，降低腎組織中氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，改善AKI大鼠病理?yè)p傷，可能為臨床治療AKI提供一定參考。但本研究也存在一定不足，并未在研究中設(shè)計(jì)通路抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證，有待后續(xù)深入研究。