劉學(xué)輝， 陳小均， 李 淳， 何海永， 陳 文， 王莉爽

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所， 貴州 貴陽 550006)

辣椒(CapsicumfrutescensL.)是常見蔬菜，其風(fēng)味獨特、營養(yǎng)價值高，深受人們喜愛。目前，辣椒產(chǎn)業(yè)是貴州12大特色產(chǎn)業(yè)之一，是脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。近年來，由番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)侵染辣椒引起的辣椒番茄斑萎病毒病，在貴州辣椒主產(chǎn)區(qū)的發(fā)生和危害日益嚴(yán)重[1]。辣椒感染TSWV后植株整體矮化并伴有黃化癥狀，葉片上出現(xiàn)褪綠條紋、黃色環(huán)紋、斑駁花葉或輪紋狀環(huán)斑，葉片有黃褐色壞死斑點，莖上出現(xiàn)壞死的條紋斑，條紋從莖部開始逐步蔓延至枝端，成熟果實則產(chǎn)生黃化，并伴有同心環(huán)或褐色壞死條紋斑點。由于對農(nóng)作物的危害嚴(yán)重，TSWV在世界十大重要植物病毒中排名居第2位[2]，是一種檢疫性植物病毒。

TSWV屬布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病屬(Orthotospovirus)[3]。1984年在我國廣州首次發(fā)現(xiàn)TSWV危害花生，隨后在煙草、辣椒及馬鈴薯等多種作物上發(fā)現(xiàn)TSWV[4-7]。自然條件下TSWV主要通過薊馬傳播，也可通過機械摩擦、嫁接等方式傳播。目前報道有9種薊馬可以傳播 TSWV，其中西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)是導(dǎo)致TSWV在世界范圍內(nèi)大面積發(fā)生的主要媒介[8]。TSWV寄主范圍廣泛，可侵染82科1 000余種植物[9]，且其能夠?qū)煵?、馬鈴薯、番茄、辣椒及銀蓮花等作物造成毀滅性危害。

由于TSWV侵染會給辣椒產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，且其傳播介體的防控比較困難，很難有效抑制病毒的傳播，所以選育TSWV抗病性辣椒品種成為目前防治TSWV經(jīng)濟、綠色且有效的方法[10]。研究表明，利用某些防御酶類的含量或活性水平變化作為植物抗病性鑒定的生化指標(biāo)，如超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等的酶活性變化與植物抗病性密切相關(guān)[11]。王莉爽等[12]2015年報道了貴州辣椒受到TSWV的危害，隨著近年來貴州農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，辣椒種植面積增加，TSWV的發(fā)生危害也日益嚴(yán)重。但目前尚未見有關(guān)貴州主栽辣椒品種對TSWV抗性的研究報道。鑒于此，以貴州本地主栽辣椒品種遵義朝天椒、百宜辣椒及感病品種茄門甜椒等作為研究材料，采用ELISA法定期測定3個品種接種TSWV后葉片中SOD、POD、CAT、PAL和PPO 5種酶的酶活性，明確不同辣椒品種酶活性與TSWV間的關(guān)系，揭示防御酶活性對TSWV的抗性生理生化機制，以期為辣椒番茄斑萎病毒病綠色防控及分子育種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1辣椒遵義朝天椒和百宜辣椒為貴州貴陽和遵義當(dāng)?shù)氐闹髟云贩N，實驗室長期繁殖保存；茄門甜椒，市購。

1.1.2病毒感染辣椒番茄斑萎病毒的葉片經(jīng)PCR鑒定后，摩擦接種并經(jīng)枯斑分離保存至普通煙K326備用。

1.1.3試劑凡科維(Fankew)ELISA酶活性檢測試劑盒，上?？婆d商貿(mào)有限公司；PBS緩沖液，北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司。

1.1.4儀器設(shè)備MultiskanGO酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific Inc.。

1.2方法

1.2.1病毒接種液制備取1 g TSWV感病葉片，加少量600目石英砂，于2 mL PBS緩沖液中研磨成勻漿，無菌水稀釋至 10 mL備用。

1.2.2試驗設(shè)計根據(jù)辣椒品種設(shè)3個處理，分別為遵義朝天椒、百宜辣椒和茄門甜椒。在辣椒苗6片真葉展開時選取長勢一致的植株，摩擦接種TSWV病毒汁液，每株辣椒接種3片葉，每個品種處理10株，3次重復(fù)，以接種PBS緩沖液的植株(健康)作為對照(CK)。用畫筆蘸取勻漿沿葉脈摩擦葉片正面，接種3 h后用無菌水沖洗葉片并將植株移入防蟲網(wǎng)培養(yǎng)。

1.2.3酶活性測定于接種前和接種后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d及15 d取樣，放于-20℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA酶活性檢測試劑盒，參照說明書，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測定各處理的吸光度(OD值)，計算SOD、POD、CAT、PAL和PPO的活性。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進行。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和DPS 10進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

2結(jié)果與分析

2.1過氧化氫酶(CAT)活性的變化

從圖1看出，接種TSWV后，隨時間延長3個辣椒品種的CAT活性均有不同程度的變化，葉片CAT活性的最大值均出現(xiàn)在接種后第7天。其中，遵義朝天椒和百宜辣椒的CAT活性均呈先升后降再升再降趨勢，二者均在第1天時達第1個峰值，第7天時達第2個峰值，2個高峰分別較同期CK提高121.49%、100.25%和32.32%、20.39%，茄門甜椒的CAT活性呈先升后降趨勢，在第7天時達峰值，峰值較CK提高87.69%。CAT活性與病情指數(shù)的線性方程為y=0.207 3x-0.010 8(R2=0.991 7)。

2.2苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化

從圖2看出，TSWV接種后隨時間延長3個辣椒品種的PAL活性均呈先升后降再升再降趨勢，其最大值均出現(xiàn)在接種后第7天，且各測定時期均較CK高，說明接種TSWV對辣椒葉片的PAL活性具有誘導(dǎo)效應(yīng)。遵義朝天椒和百宜辣椒葉片PAL活性二者均在第1天時出現(xiàn)第1個峰值，第7天時出現(xiàn)第2個峰值，2個高峰分別較同期CK提高112.56%、92.44%和59.21%、92.21%。茄門甜椒葉片PAL活性在第7天時出現(xiàn)峰值，較CK提高53.84%。3個辣椒品種CK的PAL活性基本保持穩(wěn)定。PAL活性與病情指數(shù)的線性方程為y=0.178 4x-0.064 8(R2=0.990 4)。

2.3過氧化物酶(POD)活性的變化

從圖3看出，接種TSWV后，隨時間延長3個辣椒品種的POD活性均有不同程度的變化，其最大值均出現(xiàn)在接種后第5天，第15天時接近CK的水平。遵義朝天椒和百宜辣椒葉片在接種TSWV后，POD活性在第1天時出現(xiàn)第1個峰值，較同期CK提高88.34%和44.30%；在第5天時出現(xiàn)第2個峰值且達最高值，較同期CK提高96.75%和81.16%。在第7天后POD呈迅速下降趨勢，而同期CK的POD活性則呈上升趨勢，第15天時接毒辣椒和CK葉片的POD活性基本持平。茄門甜椒POD活性在第5天時達峰值，較同期CK提高88.82%；隨著時間的推移，POD活性呈下降趨勢，到第15天時與CK的POD活性基本一致。POD活性與病情指數(shù)的線性方程為y=0.128 7x-0.012 3(R2=0.990 7)。

2.4多酚氧化酶(PPO)活性的變化

從圖4看出，接種TSWV后3個辣椒品種葉片各測試期的PPO活性均高于CK，說明TSWV侵染可增強辣椒葉片的PPO活性。遵義朝天椒和百宜辣椒PPO活性均呈先升后降再升再降趨勢，二者均在接種第1天時出現(xiàn)第1個峰值，較同期CK提高99.69%和89.06%；第5天時出現(xiàn)第2個峰值，較同期CK提高154.41%和100.73%。茄門甜椒PPO活性呈先升后降趨勢，在第1天時出現(xiàn)峰值，較同期CK提高124.64%，之后逐漸下降。3個辣椒品種CK葉片的PPO活性保持相對穩(wěn)定。PPO活性與病情指數(shù)的線性方程為y=0.264 4x-0.033 1(R2=0.978 8)。

2.5超氧化物岐化酶(SOD)活性的變化

從圖5看出，接種TSWV后3個辣椒品種葉片的SOD活性均呈先升后降趨勢。遵義朝天椒和百宜辣椒在接種后1～5 d時葉片的SOD活性較同期CK高，第7天時接毒辣椒葉片和CK的水平基本一致；但是遵義朝天椒和百宜辣椒在第9天時出現(xiàn)1個峰值后逐漸下降，而百宜辣椒CK的SOD活性呈上升趨勢，較接毒葉片高。茄門甜椒SOD活性在接種后1～9 d時較同期CK高，各時期的活性變化比較平穩(wěn)，在第11天后與CK的SOD活性相差不大。SOD活性與病情指數(shù)的線性方程為y=0.277 4x-0.022 7(R2=0.998 6)。

3結(jié)論與討論

研究選取對TSWV表現(xiàn)出不同抗性的3個辣椒品種，在接毒后定期測定SOD、POD、CAT、PAL和PPO 等5種與病原菌侵染相關(guān)防御酶的酶活性變化。研究結(jié)果表明：遵義朝天椒和百宜辣椒在接種TSWV后，CAT、PAL、POD和PPO活性出現(xiàn)2個峰值，而茄門甜椒僅出現(xiàn)1個峰值，可能是因為遵義朝天椒和百宜辣椒接種病毒后早期引起防衛(wèi)反應(yīng)出現(xiàn)1次峰值，隨著酶促反應(yīng)速度加快，催化誘導(dǎo)形成的酚類物質(zhì)積累再次出現(xiàn)峰值，從而加強了防御能力；而茄門甜椒由于病毒的繁殖和侵染導(dǎo)致寄主細胞被破壞，從而刺激防御酶活性的提高，但酶誘導(dǎo)速度和強度均較主栽品種差，不足以抑制病毒侵入，所以感病茄門甜椒出現(xiàn)1次酶活性峰值。3個品種出現(xiàn)防御酶活性最高峰的時間一致，表明接種TSWV后對辣椒葉片有一定的影響，但品種不同防御酶活性強弱有差異，與孫紅煒等[13]的研究結(jié)果相符。接種TSWV后3個辣椒品種葉片的SOD酶活性變化并不明顯，與菊花[14]的研究結(jié)果不一致，表明不同作物抗性與防御酶活性之間存在一定的關(guān)系，但并不是所有酶活性變化趨勢都一致。

毛蓮珍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，番茄品種感染TSWV后，3個自交系中SOD、POD、CHT和β-1,3-GA活性均高于CK，PPO活性低于CK，其中免疫品種(YNAU335)6種酶的活性均高于2個感病自交系。楚成茹[16]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)人工接種 TSWV后，渝辣 10號、渝椒 12號、渝椒五號、艷椒 425、早春、艷椒 11、艷椒 417和農(nóng)世纓朝天椒等8種不同重慶主栽辣椒品種的抗病性差異很大。研究結(jié)果表明，感染TSWV后貴州主栽辣椒品種遵義朝天椒和百宜辣椒與茄門甜椒葉片的防御酶活性存在差異，說明植物防御酶活性與抗性相關(guān)。其中，PAL和PPO活性顯著高于CK，與黑銀秀等[17]的研究結(jié)果相符；CAT、POD和SOD活性呈先升后降趨勢，且不同辣椒品種的防御酶活性變化幅度不同，與沈登榮等[18]報道黃胸薊馬取食致使不同辣椒品種防御酶活性逐漸上升的結(jié)果一致。表明，TSWV侵染使辣椒體內(nèi)的各種防御酶活性顯著升高，且CAT、PAL、POD和PPO活性與辣椒的抗病性呈相關(guān)趨勢，與劉琳等[19-21]研究報道一致。但是SOD活性與辣椒抗TSWV的關(guān)系并不顯著，與已報道的研究不一致，可能是受品種差異、取樣部位和取樣時間等因素的影響所致，其有待進一步深入研究。