劉丹奇 任發(fā)政 侯彩云

摘要：目的：研究和對(duì)比白茶、綠茶和紅茶粗制多糖（crude tea polysaccharides，CTPs）的降血糖效果及機(jī)理。方法：分別選取壽眉、龍井、白琳工夫作為白茶、綠茶和紅茶的代表，制備粗多糖。以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，二甲雙胍作為陽(yáng)性對(duì)照，研究粗制茶多糖對(duì)小鼠體重、空腹血糖、胰島素抵抗指數(shù)、葡萄糖耐量和胰腺組織病變情況的影響，qPCR測(cè)定小鼠肝臟中相關(guān)基因表達(dá)水平。結(jié)果：CTPs均具有降血糖功效，白茶、綠茶、紅茶多糖的空腹血糖下降率分別為470%、478%、367%;CTPs均可改善小鼠葡萄糖耐量，下調(diào)Foxo1、G6Pc、PEPCK和TXNIP基因的表達(dá)量。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)劑量條件下，研究所選粗制茶多糖提取物均具有降血糖效果，其中綠茶多糖作用最明顯。

關(guān)鍵詞：茶多糖;降血糖;糖代謝

糖尿病常用治療藥物有多種毒副作用[12]，因此尋求天然植物來(lái)源的安全功效成分十分必要。茶多糖是茶葉中存在的一類具有多種生物活性的多糖復(fù)合物，多為與蛋白質(zhì)結(jié)合的酸性糖蛋白[3]。Zhou等[4]研究發(fā)現(xiàn)，茶多糖可能是粗老茶治療糖尿病的主要藥理成分。也有研究表明，茶多酚和茶色素等成分均具有降血糖效果[57]。劉安軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以作為茶多糖的協(xié)同因子，共同發(fā)揮降血糖作用，效果優(yōu)于茶多糖單獨(dú)干預(yù)組。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中也發(fā)現(xiàn)，白茶壽眉粗多糖提取物的降血糖效果優(yōu)于多糖含量相對(duì)更高的黃大茶粗多糖提取物，茶多糖的含量與降血糖效果未呈正相關(guān)規(guī)律。近年來(lái)研究表明，茶葉種類對(duì)茶多糖的降血糖活性會(huì)產(chǎn)生影響[9]，但相關(guān)研究較少，對(duì)于白茶茶多糖缺少深入研究和對(duì)比。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)上，以壽眉白茶多糖作為研究對(duì)象，選取龍井綠茶多糖及白琳工夫紅茶多糖作為對(duì)照，旨在研究不同種類茶葉多糖降血糖效果的差異性，并進(jìn)一步探究其具體作用機(jī)制。

1材料與方法

11材料、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

白茶壽眉、綠茶龍井、紅茶白琳工夫，購(gòu)于北京馬連道茶城。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美國(guó)Sigma公司;鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司;異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇等（分析純），北京化工廠;考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所;小鼠胰島素測(cè)定試劑盒，江蘇菲亞生物科技有限公司;Trizol試劑，碧云天生物科技有限公司;EvaGreen 2X qPCR MasterMixNo Dye試劑盒、5X AllInOne RT MasterMix試劑盒，美國(guó)ABM公司;測(cè)定基因相關(guān)引物，生工生物工程（上海）股份有限公司;SPF級(jí)4周齡雄性ICR小鼠，許可證號(hào)SCXK（京）20160002，北京斯貝福生物技術(shù)有限公司;45%脂肪供能高脂高糖飼料及小鼠維持飼料，北京華阜康生物科技股份有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于屏障環(huán)境動(dòng)物房[溫度（22±2）℃、濕度50%±5%、壓差20～50 Pa，12 h晝夜交替]進(jìn)行，遵循國(guó)家及提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利規(guī)則和制度。

12儀器與設(shè)備

T 6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、RE52 AA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空冷凍干燥機(jī)、Roche活力型血糖儀、Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白檢測(cè)儀、Nikon Eclipse Ci光學(xué)顯微鏡、Biometra Tpersonal梯度PCR儀、Roche lightcycler 96熒光定量PCR儀等。

13方法

131粗制茶多糖的制備與理化成分測(cè)定茶葉使用萬(wàn)能粉碎機(jī)磨碎，過(guò)40目篩備用。準(zhǔn)確稱量茶粉，參照保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序與檢驗(yàn)方法規(guī)范中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)受試物相關(guān)的制備方法[10]，茶水比為1∶15，80℃水浴浸提1h，減壓過(guò)濾，保留濾液，濾渣重復(fù)于80℃水浴浸提1h，再次減壓過(guò)濾。合并兩次濾液，冷卻一段時(shí)間后于55℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液。之后在濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇，超聲溶解30min后，4 000 r/min離心15min，將沉淀物真空冷凍干燥36 h，分別得到粗制白茶多糖（CWP）、粗制綠茶多糖（CGP）、粗制紅茶多糖（CBP），在4℃下密封保存[11]。分別采用苯酚硫酸比色法[12]測(cè)定茶多糖含量、考馬斯亮藍(lán)試劑盒法測(cè)定蛋白質(zhì)含量、福林酚法[13]測(cè)定茶多酚含量、三氯化鋁比色法[14]測(cè)定總黃酮含量。

132動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠置于屏障環(huán)境動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取其中10只喂養(yǎng)維持飼料，作為正常對(duì)照組（NC），其余小鼠喂養(yǎng)45%高脂高糖飼料。連續(xù)喂養(yǎng)4w后，禁食12h（隔夜），小鼠腹腔注射配制的STZ溶液110 mg/（kg·BW）。1w后測(cè)定血糖，空腹血糖（FBG）≥111mmol/L視為造模成功[15]。將造模成功后的小鼠按照FBG情況隨機(jī)分為模型對(duì)照組（MC）、陽(yáng)性對(duì)照組（PC）、CWP干預(yù)組、CGP干預(yù)組和CBP干預(yù)組，每組10只小鼠。茶多糖干預(yù)組參照已有研究[16]，制定小鼠灌胃劑量為300mg/（kg·d）。PC組選用鹽酸二甲雙胍，根據(jù)成年人的每日最大劑量（15 g），按照文獻(xiàn)相關(guān)方法換算后，制定小鼠用藥劑量為250mg/（kg·d）[17]。

133葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)4w干預(yù)結(jié)束前，將所有小鼠禁食不禁水15h（隔夜），取小鼠尾尖血，使用血糖儀測(cè)定FBG，作為0時(shí)血糖。測(cè)定之后馬上給每只小鼠灌胃15g/（kg·BW）葡萄糖，記錄灌胃后30、60、90、120 min血糖，并繪制時(shí)間血糖折線圖[18]，按照式（1）計(jì)算每組折線的曲線下面積（AUC）。

AUC（mmol·h/L）=（A/2+B+C+D+E/2）/2（1）

式（1）中，A、B、C、D、E分別表示0、30、60、90、120 min時(shí)刻的血糖值。

134生化指標(biāo)檢測(cè)4w干預(yù)結(jié)束后，將小鼠禁食12h（隔夜），內(nèi)眥采血，斷頸處死。將血樣在4℃、4 000r/min條件下離心15min，分離血清樣本，于-20℃條件下保存。按照試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定血清中胰島素（FIS）含量。

135胰腺組織病理學(xué)分析剖取小鼠胰腺組織，置于體積為胰腺組織10倍的4%多聚甲醛固定液中固定48h。常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片（4μm厚），HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察胰腺組織的病理學(xué)變化，并以200倍視野拍照保存。

136實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Trizol試劑抽提小鼠肝臟RNA，使用氯仿、無(wú)水乙醇等試劑對(duì)RNA進(jìn)行清洗處理。檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量后，按試劑盒標(biāo)明的梯度程序反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈，-20℃條件下保存。熒光定量采用10μL體系，按照試劑盒標(biāo)明的梯度程序：95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 60 s，循環(huán)45次。以 GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-（ΔΔCT）法[19]對(duì)各基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。測(cè)定基因：叉頭轉(zhuǎn)錄因子（Foxo1）、葡萄糖6磷酸酶（G6Pc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCK）和硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP），引物序列如表1所示。

14數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 200軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（X±SE）表示;組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<005表示差異顯著、P<001表示差異極顯著。圖像采用Origin 80軟件處理。

2結(jié)果與分析

21茶多糖的主要成分

由表2可知，CWP中的多糖含量最高且顯著高于CGP，粗制茶多糖提取物均含有多種雜質(zhì)成分。

22茶多糖的降血糖作用相關(guān)測(cè)定結(jié)果分析

221茶多糖對(duì)糖尿病小鼠體重、始末血糖及胰島素抵抗（HOMAIR）指數(shù)的影響造模成功后的小鼠均出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀，且體重變化較為明顯。小鼠FBG在造模成功后會(huì)有顯著上升，4w灌胃干預(yù)對(duì)小鼠糖尿病的治療效果則可以通過(guò)最后1周和造模成功時(shí)FBG的變化來(lái)表明。改善小鼠的胰島素抵抗水平可有效提高胰島素敏感性，從而改善高胰島素血癥，降低小鼠血糖水平，衡量的指標(biāo)之一為HOMAIR指數(shù)[2021]，計(jì)算公式為式（2）：

HOMAIR=FBG*FIS/225（2）

如圖1A所示，NC組體重較為穩(wěn)定，MC及PC組體重波動(dòng)幅度較大，整體呈下降趨勢(shì)。多糖干預(yù)組中CWP體重與其他組差異較為明顯，但干預(yù)組均呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì)，在第3、4周趨于平緩甚至體重有所回升。為更加明顯區(qū)分組間差異性，計(jì)算各組的體重增長(zhǎng)百分比。如圖1B所示，MC組、CTPs組均呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，未表現(xiàn)出較好的改善效果。如圖1C所示，小鼠在造模成功后測(cè)定初始FBG，各組間無(wú)顯著差異（P>005）。MC組經(jīng)4w喂養(yǎng)后，F(xiàn)BG有所升高，但并未達(dá)到顯著水平。藥物和多糖干預(yù)組4w喂養(yǎng)后FBG均降低，PC、CWP、CGP、CBP組的血糖下降率分別為532%、470%、478%、367%?？芍狢TPs組降血糖效果均略遜于PC組，其中CGP組效果最好。如圖1D所示，小鼠造模成功后的IR值明顯增加，其中MC組和CWP組極顯著高于NC組（P<001），同時(shí)CWP組和CBP組顯著低于MC組（P<005），對(duì)緩解小鼠胰島素抵抗水平有一定效果，PC組及CGP組則極顯著低于MC組（P<001），均有很好地緩解胰島素抵抗效果，多糖組中CGP組效果較好。

222茶多糖對(duì)糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）是一種葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)，已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中[22]。小鼠在4w喂養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行該試驗(yàn)，如圖2A所示，多數(shù)干預(yù)組血糖值灌胃葡萄糖30min后達(dá)到頂峰，之后逐步下降，少數(shù)干預(yù)組（CWP、CBP）血糖值在30～90min之間變化緩慢。NC組小鼠血糖在120min時(shí)恢復(fù)正常，MC組血糖下降較為緩慢，表現(xiàn)出明顯的葡萄糖不耐受。為區(qū)分其他干預(yù)組的組間差異，對(duì)曲線AUC進(jìn)行計(jì)算，如圖2B所示，CWP組和CBP組較MC組有所下降，但未達(dá)到顯著水平（P>005）;CGP組顯著低于MC組（P<005），顯示出較好地改善小鼠葡萄糖耐量的效果。

223小鼠胰腺組織的病理學(xué)分析如圖3所示，NC組小鼠胰島性狀規(guī)則，胰島細(xì)胞分布均勻，腺泡細(xì)胞形態(tài)正常，組織未發(fā)生病變。MC組小鼠胰島形狀不規(guī)則，腺泡結(jié)構(gòu)被破壞，腺泡大量消失（黑色箭頭所示），并伴有組織增生，可見(jiàn)較多絲網(wǎng)狀物質(zhì)（紅色剪頭所示），整體表明MC組胰島損傷嚴(yán)重，有脂肪變性征兆。PC組胰島性狀不規(guī)則，大量胰島細(xì)胞胞質(zhì)疏松或呈空泡狀（黑色箭頭所示），局部胰島附近可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色剪頭所示），整體表明PC組小鼠胰島細(xì)胞損傷較嚴(yán)重，可見(jiàn)二甲雙胍藥物對(duì)改善小鼠胰腺組織病變的效果并不明顯。CTPs干預(yù)組中，CWP組小鼠胰島形狀不規(guī)則，少量胰島細(xì)胞胞質(zhì)呈空泡狀（黑色箭頭所示），組織整體未見(jiàn)明顯異常;CGP組小鼠胰島形狀不規(guī)則，部分胰島細(xì)胞胞質(zhì)呈空泡狀（黑色箭頭所示），一處胰島周圍有少量淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)（紅色剪頭所示），未見(jiàn)其他明顯異常;CBP組小鼠胰島形狀不規(guī)則，少量胰島細(xì)胞胞質(zhì)呈空泡狀（黑色箭頭所示），未見(jiàn)其他明顯異常。整體表明，CTPs均能部分改善小鼠胰腺組織的病理狀態(tài)，但組間差異不明顯。

224茶多糖對(duì)糖尿病小鼠肝組織相關(guān)基因表達(dá)的影響Foxo1基因是胰島β細(xì)胞的一種關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)其增殖存在抑制作用[23]，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素分泌減少，破壞糖代謝平衡，使血糖升高。由圖4A可知，MC組的基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于NC組（P<001），干預(yù)組與MC組相比均極顯著下調(diào)了基因相對(duì)表達(dá)量（P<001），其中CGP效果最優(yōu)。G6Pc基因和PEPCK基因均為糖異生途徑調(diào)控基因，在肝臟中表達(dá)量的增加會(huì)促進(jìn)非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至血管中提高血糖水平[24]。由圖4B、C可知，MC組的兩種基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于NC組（P<001），藥物和多糖干預(yù)組則與MC組相比均能夠極顯著下調(diào)兩種基因的相對(duì)表達(dá)量（P<001），但各組之間無(wú)顯著差異（P>005）。其中CGP效果最優(yōu)。TXNIP基因是一種細(xì)胞炎癥分子，其表達(dá)量的增加會(huì)促進(jìn)胰島β細(xì)胞的凋亡[25]。由圖4D可知，MC組的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于NC組（P<001），與MC組相比，藥物與多糖干預(yù)組均能極顯著下調(diào)基因相對(duì)表達(dá)量（P<001）。多糖組效果均明顯弱于PC組，其中CGP在多糖干預(yù)組中效果最優(yōu)，表明其在消除炎癥方面具有優(yōu)勢(shì)。

3討論

本研究選取的茶多糖提取物均可改善小鼠的糖尿病癥狀。以血糖下降率為主要指標(biāo)來(lái)看，降血糖效果整體呈現(xiàn)出綠茶多糖>白茶多糖>紅茶多糖的規(guī)律，未與茶多糖的含量呈正相關(guān)，但隨茶多酚含量的增加而提高。這表明茶葉中影響降血糖活性的因子不僅茶多糖一種，在茶多糖含量相對(duì)較少時(shí)，茶多酚可能會(huì)成為發(fā)揮降血糖功效的主要因子，也可能與茶多糖存在協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步佐證了實(shí)驗(yàn)室前期在白茶和黃茶粗多糖的研究中得到的茶多糖并不是唯一降血糖因子的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)所選茶多糖在調(diào)節(jié)糖尿病代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)方面也具有一定作用，均可下調(diào)糖異生途徑關(guān)鍵基因G6Pc和PEPCK的表達(dá)量，抑制葡萄糖的生成，進(jìn)而降低血糖。同時(shí)，茶多糖均可下調(diào)Foxo1基因的表達(dá)，減弱對(duì)胰島β細(xì)胞的抑制，從而增加胰島素分泌，改善糖尿病癥狀。此外，茶多糖對(duì)炎癥分子TXNIP基因的表達(dá)也有抑制作用，緩解胰島β細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而增加胰島素分泌。茶多糖的降血糖活性會(huì)受到很多因素影響，降糖作用途徑較多，靶點(diǎn)也不止一處[24]，純度、劑量、吸收方式等因素對(duì)其降血糖活性的影響及茶多糖的其他作用途徑和降糖靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究?！?/p>

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