郝旭晨 董燕婕 范麗霞 苑學霞 梁京蕓 王磊 李大鵬 趙善倉

摘要：建立高效液相色譜紫外法同時測定花生中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的方法。以85%乙醇水溶液為提取劑，采用直接超聲提取、高速勻漿提取和固相萃取3種不同提取方法處理花生樣品，對提取劑使用量和提取方法進行比較研究，高效液相色譜法進行含量測定。結(jié)果表明：當提取劑使用量為40mL時，固相萃取提取法效果最好，白藜蘆醇的加標回收率為9600%～10955%，相對標準偏差（RSD）為164%～217%，檢出限為0016mg/kg;白藜蘆醇苷的加標回收率為9182%～10467%，相對標準偏差（RSD）為173%～281%，檢出限為0052mg/kg。測定的山東省210個花生樣品中白藜蘆醇含量為017～1139mg/kg，含量最低的是花育22，最高的是白玉品種;白藜蘆醇苷含量為022～144mg/kg，含量最低的是春甜，最高的是山花9號品種。該方法適合于花生樣品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量的測定。

關(guān)鍵詞：花生;白藜蘆醇;白藜蘆醇苷;高效液相色譜法

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[1]。白藜蘆醇苷，又稱虎杖苷，是從蓼屬植物虎杖根中提取的一種多酚類物質(zhì)，化學名稱為3，4，5三羥基芪3βD葡萄糖苷，苷元為白藜蘆醇，糖部分為單D葡萄糖。白藜蘆醇分子中的羥基與葡萄糖結(jié)合而形成白藜蘆醇苷。研究表明，白藜蘆醇苷具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、減輕多種因素造成的組織器官損傷、保護肝細胞、降血脂等作用[2]。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇具有相似的生物活性，白藜蘆醇苷可在體內(nèi)代謝為白藜蘆醇[34]，在腸道中糖苷酶的作用下分離出白藜蘆醇[57]。

花生是我國主要的油料作物，富含白藜蘆醇以及白藜蘆醇苷等營養(yǎng)功能成分。高效液相色譜（HPLC）法具有高靈敏度、高效能和高速度的特點，廣泛應用于葡萄酒、虎杖、花生等樣品中白藜蘆醇的檢測[811]。韓寒冰等[12]研究珍珠紅14、粵油114、汕油523和湛油75等花生品種的廢棄物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，為花生廢棄物的綜合利用提供了科學依據(jù)。目前同時提取和測定白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的研究也主要集中在虎杖、葡萄、葡萄酒和桑椹等[1315]。楊潤濤等[16]同時測定了血漿中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量。禹珊等[17]同時測定了中藥虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷的含量。HPLC法測定白藜蘆醇的含量，樣品前處理方法的不同將直接影響測定結(jié)果[18]。白藜蘆醇難溶于水，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑[1920]，對白藜蘆醇的提取率由低到高依次為丙酮<無水乙醇<甲醇<乙醚<乙酸乙酯，因為乙醇具有無毒、安全、價格低廉、易得、易回收的特點[21]，大多選擇乙醇作為提取白藜蘆醇的試劑較適宜。

經(jīng)查閱文獻，對于同時檢測花生中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量還未有相關(guān)的研究性試驗。本研究參照GB/T 24903—2010標準優(yōu)化前處理方法，對花生中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷進行同時測定，以建立提取效果好、回收率高、重復性好的檢測方法。

1材料與方法

11試劑

白藜蘆醇，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院;白藜蘆醇苷標準品，純度≥98%，上海安譜實驗科技有限公司;乙腈（色譜純）;無水乙醇（分析純）;氧化鋁分層柱（0074～0149mm）;娃哈哈純凈水;022μm有機濾膜。

12儀器

Waters2695高效液相色譜儀，儀器配Waters 2998光電二極管陣列檢測器;IKA MS3 digital渦旋儀;Sigma 3K15醫(yī)用離心機;美國NEVAP111氮吹濃縮儀;KQ800DE超聲儀。

13方法

131標準儲備液的配制分別稱取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標準品各125mg（精確至0000 1g）置于250mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為50mg/L的白藜蘆醇、白藜蘆醇苷標準儲備液，保存于4℃。臨用時，用甲醇稀釋成不同濃度的標準使用液[22]。

132標準工作液系列的配制甲醇稀釋白藜蘆醇和白藜蘆醇苷標準貯備液得到005、01、05、10、20、50、100mg/L的混合標準溶液。

133樣品前處理方法

（1）直接超聲提取法。稱取250g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液25mL，置于80℃超聲儀中水浴超聲25min，冷卻后于5 000r/min離心5min，殘渣再用25mL 85%乙醇水溶液再次提取，充分渦旋混勻1min，重復以上超聲離心步驟，合并提取液，渦旋混勻。吸取2mL上清液，過022μm有機濾膜待用[23]。

（2）高速勻漿提取法。稱取25g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液10mL高速勻漿2min后，于4 000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中。殘渣分別用20mL 85%乙醇水溶液提取2次后合并提取液，定容。搖勻后用022μm濾膜過濾，待用[24]。

（3）固相萃取法。稱取50g花生粉狀樣品于50mL離心管中，加入85%乙醇水溶液40mL于80℃超聲水浴45min，不時振搖。靜置過夜后吸取8mL上清液過氧化鋁層析柱，收集濾液到10mL刻度管。40℃氮吹濾液至1mL，用022μm濾膜過濾，待用[22]。

134高效液相色譜條件色譜柱條件為TnatureC8色譜柱（46mm×250mm，5μm）;柱溫為25℃;檢測波長為306nm;流動相A為900μL冰醋酸+1 000mL水;流動相B為乙腈;進樣量為10μL;檢測器為二極管陣列檢測器（表1）。

2結(jié)果與分析

21標準曲線的建立

在最優(yōu)試驗條件下，對不同濃度梯度的白藜蘆醇標準品和白藜蘆醇苷標準品分別作標準曲線。結(jié)果表明，白藜蘆醇及白藜蘆醇苷混標在質(zhì)量濃度為005～10mg/L時，質(zhì)量濃度（C，mg/L）與其峰面積（A）呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0999（表2）。

24方法重復性和準確度比較

在花生粉碎樣品中添加混合標準溶液，使添加質(zhì)量分數(shù)分別為10、50、100mg/kg。每個濃度水平重復5次，分別按照步驟“121、122、123” 3種前處理方法處理樣品，進行精密度與準確度的測定，3種添加濃度的方法重復性及回收率列于表4。

3討論與結(jié)論

目前，研究白藜蘆醇苷提取的材料是虎杖[2526]和葡萄[2729]。但對花生生產(chǎn)中白藜蘆醇苷的檢測未見報道。本研究比較了3種花生樣品前處理方法的LOD、LOQ、回收率以及精密度，結(jié)果表明，固相萃取法的回收率高于高速勻漿提取法和直接超聲提取法，而且溶劑的使用量低。溶劑直接提取法提取試劑消耗量大，且提取效率不高。高速離心法的提取率略低于固相萃取柱，存在試劑消耗、提取不完全的問題。固相萃取法采用樣品提取后靜置過夜，使白藜蘆醇以及白藜蘆醇苷與萃取劑充分接觸，提高萃取效率。固相萃取柱中含有氧化鋁成分，吸附樣品基質(zhì)中的偏極性化合物，可以將白藜蘆醇和白藜蘆醇苷與花生樣品中的其他雜質(zhì)實現(xiàn)有效分離。

采用固相萃取法在獲得最佳凈化效果的同時可得到最佳的回收率，優(yōu)于高速勻漿提取法和直接超聲提取法，白藜蘆醇的加標回收率為9600%～10955%，相對標準偏差（RSD）為164%～217%;白藜蘆醇苷的加標回收率為9182%～10467%，相對標準偏差（RSD）為173%～281%。測定的山東省210個花生樣品中白藜蘆醇含量為017～1139mg/kg，含量最低的是花育22，最高的是白玉品種;白藜蘆醇苷含量為022～144mg/kg，含量最低的是春甜，最高的是山花9號品種。◇

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