王思琪 陳萍 王平

摘要：沙門氏菌是人畜共患病原菌，嚴(yán)重威脅人體健康。為有效控制沙門氏菌感染食品，預(yù)防因沙門氏菌感染而引起的食物中毒，對(duì)其進(jìn)行快速檢測(cè)很有必要。核酸適配體作為一種新型的仿生識(shí)別分子能特異性結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)，為食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的實(shí)現(xiàn)開辟了一條新的路徑。此項(xiàng)技術(shù)具有靶分子范圍廣、穩(wěn)定性好、制備及修飾方便等優(yōu)點(diǎn)。通過介紹核酸適配體的概念、作用機(jī)理及特點(diǎn)，將核酸適配體在沙門氏菌的具體應(yīng)用和發(fā)展方向作進(jìn)一步的闡述。

關(guān)鍵詞：核酸適配體;沙門氏菌;快速檢測(cè);作用機(jī)理

中圖分類號(hào)：TS207.4? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.057

Abstract：Salmonella is a pathogen shared by human and animals，which is harmful to people's health. In order to effectively control the food infected by Salmonella and prevent the food poisoning caused by Salmonella infection，it is necessary to detect it quickly. As a new biomimetic recognition molecule，aptamer can specifically bind to the target substance，which opens up a new path for the realization of food safety rapid detection technology. This technology has the advantages of wide range of target molecules，good stability，convenient preparation and modification. In this paper，the concept，mechanism and characteristics of aptamers were introduced，and the specific application and development direction of aptamers in Salmonella were further elaborated.

Key words：aptamer;Salmonella;rapid detection;mechanism

0? ?引言

食品安全始終是關(guān)乎國(guó)民健康的大事。據(jù)《中國(guó)食品安全戰(zhàn)略研究》顯示，因微生物污染而帶來的食源性疾病被視為食品安全問題之首，沙門氏菌則是威脅人們食品安全的一種極為重要的致病菌。

沙門氏菌（Salmonella）是一種威脅人體安全的人畜共患病原菌，食用被其污染的食品會(huì)引發(fā)腸胃炎、傷寒等疾病，若不及時(shí)治療，死亡率高達(dá)10%[1]，給人體健康造成威脅。我國(guó)規(guī)定檢測(cè)食品中沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)方法較為繁瑣，耗費(fèi)人力，花費(fèi)時(shí)間一般需要4～7 d[2]。在食品工業(yè)快速發(fā)展的大背景下，如何發(fā)展?jié)M足沙門氏菌高效率、低成本檢測(cè)需求的檢測(cè)技術(shù)。研究者發(fā)現(xiàn)，利用核酸適配體這種新型識(shí)別分子，可以對(duì)沙門氏菌進(jìn)行特異性識(shí)別檢測(cè)。并且核酸適配體本身具有合成方便、成本低廉、高效識(shí)別等優(yōu)勢(shì)，與當(dāng)前食源性致病菌檢測(cè)的發(fā)展方向十分契合。

1? ?沙門氏菌概述

沙門氏菌是較為常見的可引起食物中毒的致病菌之一?？赏ㄟ^糞便或者口腔進(jìn)行傳播，并且沙門氏菌傳播介質(zhì)多為禽肉、蛋、奶等食品[3]。沙門氏菌作用機(jī)理主要是通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)使毒力島Ⅰ和毒力島Ⅱ編碼的一系列毒力因子作用在宿主細(xì)胞表面并在宿主細(xì)胞中大量繁殖復(fù)制。據(jù)研究表明，沙門氏菌血清型超過2 500種[4]。目前，我國(guó)對(duì)沙門氏菌快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法為GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》，此方法的局限性在于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣等。近年來大量研究結(jié)果表明，可將核酸適配體應(yīng)用到沙門氏菌的快速檢測(cè)中。

2? ?核酸適配體概述

2.1? ?核酸適配體概念

核酸適配體（Aptamer）又稱之為適體，是運(yùn)用體外篩選技術(shù)即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選出來的一種有15～40個(gè)堿基長(zhǎng)度的單鏈結(jié)構(gòu)DNA或RNA序列[5]。可以和特定的靶分子高親和力、高特異性結(jié)合的新型寡核苷酸[6]。

2.2? ?核酸適配體的特點(diǎn)及作用機(jī)理

核酸適配體與傳統(tǒng)抗體相比有類似的抗體識(shí)別功能并且是在體外經(jīng)過化學(xué)篩選獲得的，因此也叫做“化學(xué)抗體”[7]。與此同時(shí)，核酸適配體作為新一代的識(shí)別分子也有不同于傳統(tǒng)抗體的特點(diǎn)：①核酸適配體可以結(jié)合的靶標(biāo)范圍廣泛，運(yùn)用SELEX技術(shù)可針對(duì)各類靶分子進(jìn)行核酸適配體的篩選。可以是有機(jī)染料、氨基酸、蛋白質(zhì)、致病菌等[8]。②核酸適配體合成成本較低，可以快速制備[9-10]。只需經(jīng)過一次篩選和測(cè)序后，就可以隨時(shí)通過化學(xué)合成儀進(jìn)行合成。③核酸適配體在常溫條件下可以保存，經(jīng)過高溫處理后仍然可以依據(jù)靶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行相應(yīng)折疊。④易于修飾，核酸適配體可在任何位置進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物常常選為有機(jī)熒光標(biāo)記物、氧化還原標(biāo)記物及納米粒子等[11]。⑤核酸適配體具有高親和力、高特異性的優(yōu)勢(shì)。由于在SELEX篩選過程中，具備親和性的核酸適配體不斷富集于文庫(kù)中，因此文庫(kù)對(duì)靶分子的親和性不斷提高[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液中有目標(biāo)物存在時(shí)，核酸適配體能在特定的條件下通過氫鍵、靜電相互作用，堿基堆積、范德華力及構(gòu)象互補(bǔ)等方法折疊，依據(jù)靶標(biāo)的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行折疊，進(jìn)而形成某種特殊三維結(jié)構(gòu)，如假結(jié)、發(fā)卡、G - 四分體、凸環(huán)[13]對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行特異性識(shí)別。

3? ?核酸適配體在沙門氏菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1? ?熒光適配體技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌

熒光檢測(cè)沙門氏菌的原理是當(dāng)核酸適配體與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合后，用熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)來修飾核酸適配體，加入靶標(biāo)菌后改變適配體的構(gòu)象，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)差異[14]。Duan N等人[15]構(gòu)建出一種由AccuBlue（一種適配體鏈）染料與部分適配體雜交的互補(bǔ)鏈（cDNA）組成的傳感器，當(dāng)沙門氏菌不存在時(shí)，適配體不與靶標(biāo)結(jié)合，不引起DNA鏈斷裂使得熒光染料AccuBlue熒光增強(qiáng)。當(dāng)沙門氏菌存在時(shí)，靶標(biāo)與核酸適配體特異性結(jié)合導(dǎo)致DNA鏈斷裂，熒光信號(hào)強(qiáng)度變?nèi)?。使用該法檢測(cè)沙門氏菌，檢出限達(dá)25 CFU/mL。Wang R J等人[16]通過適配體標(biāo)記熒光碳點(diǎn)的方法對(duì)存在于雞蛋殼和自來水中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為50 CFU/mL。蔣曉華等人[17]研究合成對(duì)核酸適配體有高親和力的金屬有機(jī)骨架材料Uio-66-NH2，構(gòu)建出熒光生物傳感器特異性識(shí)別沙門氏菌，此方法檢出限為7 CFU/mL，線性范圍為1×101～1×105 CFU/mL。

3.2? ?電化學(xué)適配體技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌

電化學(xué)適配體技術(shù)是將核酸適配體和電化學(xué)傳感元件固定在電極上，加入靶標(biāo)之后引起電極表面修飾物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，電化學(xué)信號(hào)發(fā)生改變，進(jìn)而對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行定量及定性分析檢測(cè)[18]。Hasan M R等人[19]通過一步電沉積法在工作電極上修飾多壁碳納米管，然后與沙門氏菌適配體連接以形成沙門氏菌適體傳感器，使用該法檢測(cè)顯示腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢出限分別為55 CFU/mL和67 CFU/mL。裴倩倩[20]構(gòu)建了電化學(xué)傳感器用于特異性檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，該方法利用核酸適配體與鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行特異性結(jié)合，引發(fā)ExoⅢ催化的多重信號(hào)放大反應(yīng)，在最佳條件下，檢測(cè)范圍1×101～1×107 CFU/mL。

3.3? ?表面增強(qiáng)拉曼散射適配體技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌

表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）是基于納米技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)發(fā)展而來的技術(shù)。具有樣品量少、采集速度快等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品安全等領(lǐng)域。Li H等人[21]將沙門氏菌與適配體結(jié)合，選用對(duì)氨基苯硫酚（PATP）作為拉曼活性信號(hào)分子，使棒狀金納米粒子（GNRs）和拉曼熱點(diǎn)形成的等離子體耦合，在菌液濃度為56×107～56×107 CFU/mL，檢測(cè)限達(dá)9 CFU/mL。該方法已用于鼠傷寒沙門氏菌在牛奶中的檢測(cè)。Xumin X等人[22]構(gòu)建出一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射的鼠傷寒沙門氏菌傳感器。金納米粒子作為捕獲探針，被Cy3標(biāo)記的互補(bǔ)序列修飾的納米金顆粒作為信號(hào)探針。當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌存在時(shí)，與核酸適配體結(jié)合，使其部分從互補(bǔ)序列中脫雜，降低拉曼強(qiáng)度。在最佳條件下，濃度范圍為1×102～1×107 CFU/mL時(shí)菌落數(shù)呈對(duì)數(shù)線性增加，檢測(cè)限達(dá)35 CFU/mL。該方法在? 1 h內(nèi)即可完成，并成功地應(yīng)用于加標(biāo)牛奶樣品的分析，結(jié)果良好，特異性高。

3.4? ?比色適配體技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌

Wu W H等人[23]研究出一種基于無標(biāo)記核酸適配體和金納米粒子形成的適配體生物傳感器，將目標(biāo)菌與適配體進(jìn)行結(jié)合，吸附在未修飾的金納米粒子表面以捕獲目標(biāo)菌，并通過目標(biāo)菌誘導(dǎo)使得金納米粒子發(fā)生聚集，在高鹽條件下由紅色變?yōu)樽仙瑱z出限為105 CFU/mL。Duan N等人[24]以金納米粒子為比色探針，磁性納米粒子為分離探針，建立了一種靈敏、簡(jiǎn)便的鼠傷寒沙門菌檢測(cè)方法。首先，將適配體分別固定在金納米粒子和磁性納米粒子表面;然后，將鼠傷寒沙門氏菌加入溶液中，納米粒子表面的適體能夠特異性地與靶標(biāo)結(jié)合形成三角結(jié)構(gòu)復(fù)合物，引起懸浮液褪色和紫外可見光信號(hào)變?nèi)?，進(jìn)而對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)分析，檢測(cè)范圍為25～105 CFU/mL，檢出限達(dá)10 CFU/mL。

3.5? ?表面等離子體共振適配體技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)靈敏度高、操作性強(qiáng)，該技術(shù)利用金屬薄膜光學(xué)耦合產(chǎn)生的物理現(xiàn)象來檢測(cè)物質(zhì)。Xu Y等? 人[25]設(shè)計(jì)出新型、Ω型光纖局部化表面等離子共振適配體傳感器用于實(shí)時(shí)檢測(cè)沙門氏菌，固定在等離子體表面的適配體能夠特異性捕獲鼠傷寒沙門氏菌，導(dǎo)致吸收峰的劇烈變化，檢出范圍為5×102～1×? 108 CFU/mL，檢出限達(dá)128 CFU/mL。Oh S Y等人[26]設(shè)計(jì)出表面等離子共振芯片，將約為20 nm金納米顆粒組裝到透明基底上與適配體連接。當(dāng)沙門氏菌存在時(shí)，改變芯片的消光位移，從而達(dá)到檢測(cè)沙門氏菌的目的，該方法檢出限為104 CFU/mL。狄文婷[27]構(gòu)建了表面等離子體共振生物傳感器檢測(cè)腸炎沙門氏菌的方法，結(jié)果表明其最低檢出限為2 CFU/mL。對(duì)超市購(gòu)買來的雞柳、豬肉、蝦、魚食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，其所含有的沙門氏菌含量分別為0，2～10，0，15～20 CFU/mL，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行平板計(jì)數(shù)驗(yàn)證分別為0，4，0，18 CFU/mL，證明了此檢測(cè)方法的可靠性。

3.6? ?納米金適配體技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌

納米金是一種直徑在1～100 nm極為微小的顆粒，具有催化作用強(qiáng)、生物相容性強(qiáng)等特點(diǎn)。當(dāng)前有研究者利用納米金與適配體結(jié)合技術(shù)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)。具體來說，適配體與納米金在溶液中結(jié)合，當(dāng)出現(xiàn)沙門氏菌時(shí)，適配體特異性結(jié)合靶物質(zhì)，從而引起納米金狀態(tài)改變，進(jìn)而對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行定量及定性分析。當(dāng)菌液濃度范圍為1×101～ 1×106 CFU/mL時(shí)，檢測(cè)限達(dá)7 CFU/mL[28]，此方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中的沙門氏菌進(jìn)行靈敏并且快速檢測(cè)。

4? ?結(jié)語

綜上所述，核酸適配體靶標(biāo)范圍廣、穩(wěn)定性好、合成方便、易于修飾、親和力強(qiáng)，能夠特異性識(shí)別多種目標(biāo)物質(zhì)。與熒光、電化學(xué)、表面增強(qiáng)拉曼散射、比色、表面等離子體共振、納米金等技術(shù)相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)高靈敏、低成本的檢測(cè)要求，因此成為了沙門氏菌快速檢測(cè)方法的研究熱點(diǎn)。近年來，核酸適配體高效篩選技術(shù)的研究得到了重大突破，提高了篩選的效率及質(zhì)量。相信通過研究人員的不斷努力，在其他食源性致病菌或其他領(lǐng)域高效快速檢測(cè)中，核酸適配體會(huì)得到更加深入的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

任防振，徐國(guó)勛. 兼氧/好氧膜生物反應(yīng)器處理食品廢水研究[J]. 上海理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（3）：285-288，293.

龐璐，張哲，徐進(jìn). 2006-2010年我國(guó)食源性疾病暴發(fā)簡(jiǎn)介[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2011，23（6）：560-563.

程浩. 食品中沙門氏菌檢測(cè)方法比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（30）：202-204.

嚴(yán)杏. 核酸適配體對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)及其菌膜的控制[D]. 長(zhǎng)沙：湖南師范大學(xué)，2016.

Li Q，Wang Y D，Li G S，et al. Split aptamer mediated endonuclease amplification for small. molecule detection[J]. Chemical Communications，2015，51（20）：4 196-4 199.

Thiel W H，Thiel K W，F(xiàn)lenker K S，et al. Cell-internalization SELEX：method for identifying cell Internalizing RNA aptamers fordelivering siRNAs to target cells[J]. Methods Mol Biol，2015（5）：187-199.

Song S，Wang L，Li J，et al. Aptamer-based biosensors[J]. Trends in Analytical Chemistry，2008，27（2）：108-117.

Duan N，Wu S J，Dai S L，et al. Advances in aptasensors for the detection of food contaminants[J]. Analyst，2016（13）：3 942-3 961.

Ellington A D，Szostak J W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J]. Nature，1990（8）：818-822.

Gold L，Tuerk C. Systematic evolution of ligands byexponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J]. Science，1990（2）：505-510.

Jing Z，Battig M R，Yong W. Aptamer-based molecular recognition for biosensor development[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry，2010（4）：2 471-2 480.

Tombelli S，Minunni M. Analytical applicayions of aptamers[J]. Biosensors and Bioelectronices，2005（20）：2 424-2 434.

段諾. 食源性致病菌適配體的篩選及分析應(yīng)用研究[D]. 無錫：江南大學(xué)，2013.

Sun Y，Xu J，Li W，et al. Simultaneous detection of ochratoxin A and fumonisin B1 in cereal samples using an aptamer-photonic crystal encoded suspension array[J]. Analytical Chemistry，2014（23）：11 797-11 802.

Duan N，Wu S J，Ma X Y，et al. A universal fluorescent aptasensor based on AccuBlue dye for the detection of pathogenic bacteria[J]. Anal Biochem，2014（1）：1-6.

Wang R J，Xu Y，Zhang T，et al. Rapid and sensitive detection of Salmonella typhimurium using aptamer-conjugated carbon dots as fluorescence probe[J]. Anal Methods，2015（5）：1 701-1 706.

蔣曉華，丁文捷，欒崇林，等. 金屬有機(jī)骨架材料——核酸適配體熒光法檢測(cè)沙門氏菌[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2018（5）：556-561.

Ma X，Jiang Y，Jia F，et al. An aptamer-based electrochemical biosensor for the detection of Salmonella[J]. Journal of Microbiological Methods，2014（11）：94-98.

Hasan M R，Pulingam T，Appaturi J N，et al. Carbon nanotube-based aptasensor for sensitive electrochemical detection of whole-cell，Salmonella[J]. Anal Biochem，2018（5）：34-43.

裴倩倩. 基于等溫信號(hào)放大的沙門氏菌電化學(xué)核酸適配體傳感器研究[D]. 濟(jì)南：濟(jì)南大學(xué)，2018.

Li H，Chen Q，Ouyang Q，et al. Fabricating a novel Raman spectroscopy-based aptasensor for rapidly sensing Salmonella typhimurium[J]. Food Analytical Methods，2017（9）：? ?3 032-3 041.

Xumin X，Xiaoyuan M，Haitao W，et al. Aptamer based SERS detection of Salmonella typhimurium using DNA-assembled gold nanodimers[J]. Microchimica Acta，2018（7）：325-329.

Wu W H，Li M，Wang Y，et al. Aptasensors for rapid detection of Escherichia coli，O157：H7 and Salmonella typhimurium[J]. Nanoscale Res Let，2012（1）：658-665.

Duan N，Xu B C，WU S J，et al. Magnetic nanoparticles-based aptasensor using gold nanoparticles as colorimetric probes for the detection of Salmonella typhimurium[J]. Anal Sci，2016，32（4）：431-436.

Xu Y，Luo Z W，Chen J M，et al. Omega-shaped fiber-optic probe-based localized surface plasmon resonance biosensor for real-time detection of Salmonella typhimurium [J]. Anal Chem，2018（6）：13 640-13 646.

Oh S Y，Heo N S，Shukla S，et al. Development of gold nanoparticleaptamer-based LSPR sensing chips for the rapid detection of Salmonella typhimurium in pork meat [J]. Sci Rep，2017（1）：10 130-10 140.

狄文婷. 食品中腸炎沙門氏菌以核酸適配體為識(shí)別元件的SPR快速檢測(cè)[D]. 天津：天津科技大學(xué)，2017.

Ramlal S，Mondal B，Lavu P S，et al. Capture and detection of Staphylococcus aureus with dual labeled aptamers to cell surface components[J]. International Journal of Food Microbiology，2018（5）：74-83. ◇