何棟，黎楊楊，陳冬玲

(陽江市人民醫(yī)院檢驗科，廣東 陽江 529500)

對人體來說，當出現(xiàn)不明原因導致的血小板水平低于正常值時，就會造成人體出現(xiàn)出血傾向[1]?；颊咧髟V皮膚粘膜出血、消化道出血等癥狀入院就診，臨床醫(yī)生通過對患者進行一系列檢查后，可診斷出患者患有血小板減少癥，但因為找不到患者血小板減少病因，將患者病癥歸為原發(fā)性血小板減少癥[2]。由于原發(fā)性血小板減少癥造成嚴重出血情況會使人體受到極大的危害，所以對于原發(fā)性血小板減少癥，要高度重視并積極選用科學的治療方法和預后措施[3～4]。因此針對于該病檢測顯得尤為重要，目前針對原發(fā)性血小板減少癥患者檢測手段眾多，對于該病患者進行ANA及ANAs檢測研究相對較少。本文主要探討抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)及抗核抗體譜(antinuclear antibody spectrum，ANAs)在原發(fā)性血小板減少癥患者診斷中的應用研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在2016年1月至2020年3月期間我院收治的114例初步診斷為原發(fā)性血小板減少癥的患者作為研究對象。年齡范圍3～91歲，平均(51±6.86)歲，男性40例，女性74例?；颊咴谝话阗Y料上幾乎無差異。

納入標準：(1)臨床診斷與原發(fā)性血小板減少癥診斷標準相符合[5-6]；(2)無惡性腫瘤、其他內分泌疾病等合并疾病情況；(3)向患者及家屬講解此次研究，獲得患者與家屬同意。排除標準：(1)患者存在嚴重精神病史或表達功能嚴重喪失；(2)具有嚴重的心肝肺臟器疾病者。

1.2 方法

患者檢測前需要禁食12 h后采集空腹外周靜脈血5 mL。采血完成后要及時對標本標記，并以3000 r/min離心10 min，分離血清后冷凍保持待測，間接免疫熒光方法檢測ANA陽性率，歐盟印跡法測定ANAs陽性率，包括測定ANAs中的抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP、抗核糖體P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1陽性率。步驟如下：

ANA檢測：(1)試劑盒開封后，置于室溫下進行20～30 min平衡；(2)1∶100稀釋血清標本。每次實驗均需加入陽性和陰性對照。對照血清使用前必須混勻；(3)在加樣板的每個反應區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板；(4)將載片蓋在加樣板對應的凹槽里，反應即開始。確保每個標本均能夠與生物薄片相接觸，而標本之間不相互接觸。室溫(18 ℃～25 ℃)溫育30 min；(5)將20 μL熒光標記的抗人球蛋白加入潔凈加樣板的每個反應區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育。從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載5 s內用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意避免陽光直射載片。室溫(18 ℃～25 ℃)溫育30 min。用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5 min?？稍诿?50 mL磷酸鹽緩沖液中加10滴伊文氏藍進行復染；(6) 結果評估，熒光顯微鏡下觀察熒光。若細胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細胞，不發(fā)熒光為陰性。抗原片中出現(xiàn)陽性染色細胞為ANA陽性，否則為陰性。(待測血清按照1∶100、1∶320、1∶1000、1∶3200這4個滴度進行測試)

ANAs檢測：(1)預處理：取出所需的膜條，將其放入溫有槽內。膜條上有編號的一面朝上，所有樣本均進行稀釋處理。加1.5 mL的樣本緩沖液于溫育槽中，置于室溫下(18 ℃～25 ℃)搖擺搖床上進行5 min溫育，除去剩余液體；(2)血清進行溫育：加1.5 mL血清樣本于溫育槽，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進行30 min溫育；(3)溫育槽清選：除去槽內多余液體，加1.5 mL清洗緩沖液于溫育槽中，置于室溫下(18 ℃～25 ℃)搖擺搖床上進行5 min膜條清洗，分3次進行；(4)酶結合物育：加1.5 mL酶結合物樣本于溫有槽中，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進行30 min溫育；(5)溫育槽清選：除去槽內多余液體，加1.5 mL清洗緩沖液于溫育槽中，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進行5 min膜條清洗，分3次進行；(6)底物溫有：加1.5 mL底物液于溫有槽中，置于室溫(18 ℃～25 ℃)下?lián)u擺搖床上進行10 min溫育；(7)終止：除去槽內多余液體，加蒸餾水于溫育槽中，置于室溫下(18 ℃～25 ℃)搖擺搖床上進行1 min膜條清洗，分3次進行；(8)結果評估：在進行結果判定的模板中放置檢測膜條，風干后進行評估判定。檢測質量控制程序：在檢測膜條的質控帶處，若質控帶相應抗原位置發(fā)生顯色反應，則操作正確(待測血清按照1∶100、1∶320、1∶1000、1∶3200這4個滴度進行測試)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 ANA及ANAs測定結果比較

所有患者進行檢測后發(fā)現(xiàn)，ANAs陽性率44%明顯高于ANA陽性率37%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 ANA及ANAs測定結果比較

2.2 ANA及ANAs測定結局比較

所有患者進行檢測后發(fā)現(xiàn)，進行ANAs檢測，患者的確診率為88%，明顯高于進行ANA檢測患者的確診率16%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 ANA及ANAs測定結局比較

2.3 ANAs呈現(xiàn)陽性患者相關抗體陽性率比較

在ANAs中的抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP/SM、抗核糖體P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1中，抗SSA陽性率表達，見表3。

表3 ANAs呈現(xiàn)陽性患者相關抗體陽性率比較

3 討 論

血小板減少癥是指負責人體凝血功能，存在于外周血中的血小板水平低于人體正常值，導致人體出現(xiàn)出血傾向或凝血障礙，發(fā)生自發(fā)性出血癥狀[7-8]。癥狀輕微的患者，基本不會對生活造成影響，但病情較重的患者會出現(xiàn)皮膚粘膜出血、牙齦出血、女性月經(jīng)期間出血量增多，甚至有的患者會出現(xiàn)腦出血，內臟自發(fā)性出血等危及生命的癥狀，因此一旦發(fā)生血小板減少癥，要高度重視并科學的進行治療和預后[9-11]。臨床上將血小板減少癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，繼發(fā)性血小板減少癥是在人體出現(xiàn)器臟疾病、自身免疫疾病、感染、腫瘤等疾病時的并發(fā)癥狀，經(jīng)過完善醫(yī)療檢查就可找到病因，對癥下藥治療后，患者血小板減少得以緩解[12]。但原發(fā)性血小板減少癥在排除上述癥狀后通常無法找到病因，該病發(fā)病機制與遺傳、免疫系統(tǒng)紊亂等復雜因素有關[13]。由于該病具有病程長，可反復等難以控制的因素，需要患者長期進行專業(yè)的治療和隨訪，對患者生活和健康造成嚴重影響。

為了及時掌握原發(fā)性血小板減少癥患者健康情況，對該病患者開展有效治療和預后措施，近年來，臨床對原發(fā)性血小板減少癥診斷開辟了多種檢測方式。ANA是對細胞核內遺傳物質、蛋白質等分子復合物產(chǎn)生的自身抗體，存在于IgG中，由于其具有能識別各種細胞核組分，能特征性地出現(xiàn)于許多自身免疫性疾病中，當ANA呈現(xiàn)陽性時，可判斷如原發(fā)性血小板減少癥及相關自身免疫疾病的活動性及預后，觀察治療反應，指導臨床治療。ANAs是抗核抗體的一種總稱，它主要包括3種不同的抗體：DNA、組蛋白以及非組蛋白。主要就是種屬不同。ANAs的檢測，其陽性表達不僅能診斷一些結締組織病，還能有針對性檢測出特異性抗體?？箂sa、ssb、Ro-52抗體是干燥綜合癥的一種抗體[14-18]。抗Jo-1抗體是皮肌炎的標記性抗體[19]。抗scl-70抗體是系統(tǒng)性硬化的標記性抗體等。在本次研究中，所有患者通過間接免疫熒光方法對ANA進行檢測，歐盟印記法對ANAs進行檢測，對比分析發(fā)現(xiàn)，ANAs陽性率44%明顯高于ANA陽性率37%，說明ANAs特異性更高。對所有患者最終確診為原發(fā)性血小板減小癥患者確診率進行比較ANAs確診率88%明顯高于ANA確診率16%，同時ANAs呈陽性患者中抗抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP/SM、抗核糖體P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1中等8種抗體，其中抗SSA陽性率為80%，說明ANAs譜中抗SSA分布最廣，原發(fā)性血小板減少癥中沒有表達的抗體有抗Scl-70、抗Jo-1。通過統(tǒng)計對比還發(fā)現(xiàn)ANAs抗體中聯(lián)合表達陽性率為36%明顯高于單項表達陽性率17%，說明各抗體間存在一定關聯(lián)。

在原發(fā)性血小板減少癥臨床診斷體會：在臨床診斷原發(fā)性血小板減少癥過程中，由于該病病因復雜，在對患者進行完善醫(yī)學檢查，排除其他疾病病因后，需要進行自身抗體檢查，而在進行ANA及ANAs檢測時，單一檢測ANAs患者最終確診率顯然比進行ANA檢測高，但當聯(lián)合進行ANA及ANAs檢測時，患者確診率比任何單一檢查確診率更高。因此，對于原發(fā)性血小板減少癥患者進行ANA及ANAs聯(lián)合檢測，能減少漏診率。

綜上所述，對原發(fā)性血小板減少癥患者進行ANA及ANAs檢測，能提高陽性檢出率，保障患者檢測效果有效，對臨床診治具有實用有效價值。