常力川，史殿志，姜東

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2.遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團撫礦總醫(yī)院檢驗科，遼寧 撫順 113008)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于卵巢癌[1-2]。對于晚期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者，目前的治療方案有限。

膜聯(lián)蛋白A7是膜聯(lián)蛋白超家族的成員之一[3]。ANXA7與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在惡性腫瘤的血管生成，增殖，凋亡，粘附，侵襲和遷移中起著重要作用[4]。人附睪蛋白4是通過基因組和蛋白質(zhì)組篩選鑒定的卵巢癌腫瘤標志物。研究表明，HE4的過度表達不僅存在于卵巢癌患者中，也存在于肺腺癌，乳腺癌，胰腺癌等患者中[5]。ANXA7和HE4的表達同時上調(diào)，促進了卵巢癌的惡性行為[6-7]。血清HE4可作為子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后指標和術(shù)前風(fēng)險評估指標[8]。然而，目前為止，尚沒有研究同時測試ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜癌中的表達。本研究，我們通過免疫組織化學(xué)方法同時比較了ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜組織中的表達水平，分析了兩種分子的相關(guān)性，并研究它們對子宮內(nèi)膜癌發(fā)展的影響及其相互作用。

1 實驗材料與方法

1.1 標本的收集

本研究人群由132名患者組成，于 2013年至2018年期間從本院婦產(chǎn)科收集標本。石蠟固定的病理標本由專家進行組織病理學(xué)確診：子宮內(nèi)膜癌，n=84；子宮內(nèi)膜不典型增生(輕度增生，n=8；中度增生，n=9；嚴重增生，n=13)，n=30；和子宮內(nèi)膜(分泌期，n=9，增殖期，n=9，見表1)。從患有不良生育能力的患者收集正常的子宮內(nèi)膜標本。

1.2 細胞與試劑

子宮內(nèi)膜癌細胞系(HEC-1A和Ishikawa)和卵巢癌細胞系(CaoV-3)購自上海細胞培養(yǎng)中心；山羊抗HE4多克隆抗體和小鼠抗人ANXA7單克隆抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)染色檢測HE4和ANXA7的表達

使用5 μm連續(xù)切片切割子宮內(nèi)膜組織樣本，進行免疫組織化學(xué)染色。通過免疫組化鏈霉抗生物素蛋白過氧化物酶染色分析，HE4和ANXA7在卵巢癌組織中的表達模式。常規(guī)使用陽性和陰性免疫組織化學(xué)對照。將陰性對照與兔IgG一起孵育，代替一抗。HE4和ANXA7的一抗的工作濃度分別為1∶1000(山羊抗HE4多克隆抗體)和1∶1200(小鼠抗人ANXA7單克隆抗體)。取生長指數(shù)期的細胞，消化培養(yǎng)。當(dāng)以單層生長30%～40%匯合的貼壁細胞時，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min。其余步驟與免疫組化相同。細胞膜和細胞質(zhì)中表達棕黃色顆粒，認定為陽性結(jié)果。根據(jù)色素濃度強度，沒有色素沉著、淺黃色、棕黃色、棕色和棕褐色分別評分為0～4。從每個切片中選擇5個視野，進行評分并取出色素細胞的平均百分比：占不到5%的色素細胞為0；5%到25%為1；26%到50%為2；51%至75%為3；大于75%為4。乘以這兩個數(shù)字，0到2被標記為(-)；3至4標記為(+)；5至8標記為(++)；和9到12標記為(+++)。

1.4 免疫共沉淀和Western Blot

將RIPA緩沖液(1 mL)加入子宮內(nèi)膜癌細胞和卵巢癌細胞中，然后在4 ℃下溫育30 min。在4 ℃以15 000 g離心30 min后，收集上清液并用2 μg小鼠抗ANXA7單克隆或山羊抗HE4多克隆抗體處理。在4 ℃下保持3 h。然后，加入20 μL蛋白質(zhì)A/G PLUS-瓊脂糖，然后在搖床平臺上于4 ℃下溫育過夜。用山羊IgG代替一抗作為陰性對照。隨后對免疫沉淀物進行12%SDS凝膠電泳，并使用HE4單克隆和ANXA7單克隆抗體，通過蛋白質(zhì)印跡進行分析。使用ECL試劑使蛋白質(zhì)可視化。實驗重復(fù)3次。

1.5 雙標記免疫熒光法

選擇在免疫組織化學(xué)中顯示ANXA7和HE4陽性表達的子宮內(nèi)膜組織切片，子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1A和Ishikawa進行雙標記免疫熒光法。切片和細胞同時用針對HE4(1∶50)和ANXA7(1∶50)的一抗進行培養(yǎng)。用陰性對照的兔IgG代替一抗。異硫氰酸熒光素(FITC)和異硫氰酸四乙酯(TRITC)的工作濃度為1∶50。細胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)等級資料采用秩和檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。Spearman相關(guān)分析用于分析兩種蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性。P<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜癌組織切片和細胞中的形態(tài)學(xué)表達情況

免疫細胞化學(xué)檢測的結(jié)果證實了ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜癌細胞系中均有表達(Ishikawa和HEC-1A，見圖1A)。免疫熒光顯示通過紅色熒光標記的ANXA7和通過綠色熒光標記的HE4在子宮內(nèi)膜癌細胞系(見圖1B)和不同子宮內(nèi)膜組織(見圖2)的細胞膜和細胞質(zhì)中的共表達，并且觀察到重疊的橙色熒光。

A：通過免疫細胞化學(xué)檢測卵巢癌細胞CaoV3(a，d)和子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A(b，e)，Ishikawa(c，f)中的ANXA7和HE4的表達;B：雙標記免疫熒光顯示HE4和ANXA7在HEC-1A(a～d)和Ishikawa(e～h)中的共定位表達?！凹t色”：ANXA7；“綠色”：HE4；“藍色”：細胞核；“橙色”：ANXA7和HE4的共定位圖片放大倍數(shù)為400倍(A，B)，左上角的小方框中為800倍(B)

通過惡性組織(a～d)，非典型組織(e～h)和正常組織(i～l)中的雙標記免疫熒光檢測ANXA7和HE4的共定位

2.2 ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜癌組織切片和細胞中的蛋白表達情況

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果證實ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜癌細胞系中均有表達(Ishikawa和HEC-1A，見圖3A)。免疫共沉淀測試檢測到兩種細胞系中ANXA7和HE4之間的相互作用，見圖3B和3C。

A：Western印跡檢測卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌細胞系(CaoV3，HEC-1A，Ishikawa)中ANXA7和HE4的表達；B和C：免疫共沉淀檢測抗ANXA7抗體(B)和抗HE4抗體(C)在CaoV3和Ishikawa和HEC-1A細胞系中的表達

2.3 ANXA7和HE4在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達

ANXA7和HE4著色主要發(fā)生在細胞膜中，在細胞質(zhì)中也可觀察到，見圖4。ANXA7在子宮內(nèi)膜癌，不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達率分別為95.2%(80/84)，83.3%(25/30)和55.6%(10/18)。實驗數(shù)據(jù)采用秩和檢驗分析結(jié)果為惡性和非典型增生組織中的陽性表達率顯著高于正常組織中的陽性表達率(兩者P<0.05)；ANXA7在中、重度不典型增生組中的陽性表達率分別為88.9%(8/9)和84.6%(11/13)，均高于輕度組(75.0%[6/8]，兩者P> 0.05)；分泌期子宮內(nèi)膜陽性表達率為66.7%(6/9)，高于增殖期子宮內(nèi)膜(44.4%[4/9]，P> 0.05)，見表1。

子宮內(nèi)膜癌組HE4陽性表達率為85.7%(72/84)，明顯高于非典型增生組66.7%(20/30)，正常對照組為16.7%(3/18，兩者P<0.05)；HE4在不典型增生中的陽性表達率也顯著高于正常對照組(P<0.05)；中、重度不典型增生組HE4陽性表達率分別為77.8%(7/9)和76.9%(10/13)，均高于輕度不典型增生組(37.5%[3/8]，兩者P>0.05)；分泌期內(nèi)膜中陽性表達率為22.2%(2/9)，略高于增生期子宮內(nèi)膜(11.1%[1/9]，P>0.05)，見表1。

惡性組織(a，d)，非典型組織(b，e)，正常組織(c，f)中ANXA7和HE4的免疫組織化學(xué)染色照片；圖片放大倍率為200倍，左上角的小方框中放大2倍

表1 ANXA7和HE4在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達

2.4 ANXA7和HE4表達的相關(guān)性

在ANXA7-/HE4-、ANXA7-/HE4+、ANXA7+/HE4-和ANXA7+/HE4+組中分別有2例、2例、10例和70例患者。相關(guān)分析顯示，ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜癌中的表達呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.228，P=0.037)，見表2。

表2 子宮內(nèi)膜癌中ANXA7和HE4表達之間的相關(guān)性

3 討 論

ANXA7是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，廣泛存在于腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和單核細胞的細胞膜。ANXA7參與膜轉(zhuǎn)運和一系列膜表面鈣調(diào)蛋白依賴的生物功能活動，包括細胞遷移、炎癥反應(yīng)、纖維蛋白溶解、胞吐作用、內(nèi)吞作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、分化和凋亡等[9]。ANXA7在生物活性和腫瘤進展中起重要作用[10-11]。HE4因其在卵巢癌中的高度特異性表達而受到關(guān)注。通過質(zhì)譜分析、免疫共沉淀和免疫熒光，證實了這兩種蛋白質(zhì)在卵巢癌細胞中的相互作用，以及發(fā)現(xiàn)ANXA7和HE4的組合激活MAPK和FOCAL信號通路，促進卵巢癌細胞的侵襲和遷移[12]。

本研究采用免疫印跡和免疫細胞化學(xué)方法檢測ANXA7和HE4在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達，并通過免疫共沉淀和雙標記免疫熒光證實，其在子宮內(nèi)膜癌細胞中的相互作用。我們進一步檢測了ANXA7和HE4的表達水平，并顯示ANXA7在子宮內(nèi)膜癌和非典型增生中的表達水平顯著高于正常子宮內(nèi)膜。因此，ANXA7與HE4相互作用以促進子宮內(nèi)膜癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究首次檢測ANXA7和HE4在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并分析ANXA7與HE4表達之間的相關(guān)性，提示ANXA7和HE4可能在其中起重要作用。此外，目前的研究發(fā)現(xiàn)，除了卵巢癌，ANXA7和HE4也在子宮內(nèi)膜癌中相互作用，并共定位于細胞膜和細胞質(zhì)中。