侯陽(yáng)，劉學(xué)政

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種具有代表性的退行性視網(wǎng)膜變性疾病。即患者最終都會(huì)因視網(wǎng)膜感光細(xì)胞死亡而致視功能下降甚至完全喪失。RP已成為發(fā)達(dá)國(guó)家主要的致盲性眼病?；疾÷始s0.03%。目前主要治療方法為藥物治療、視網(wǎng)膜色素上皮移植以及新近展開研究的基因治療，但對(duì)RP的臨床治療效果仍不理想。N-甲基-N-亞硝基脲(MNU) 屬于亞硝基化合物中的亞硝酸胺類，是廣泛分布于環(huán)境中的強(qiáng)烷化劑。烷化劑對(duì)細(xì)胞DNA的損傷如果沒有被修復(fù)，則細(xì)胞將發(fā)生凋亡。由于MNU誘導(dǎo)的感光細(xì)胞損害具有高度的可重復(fù)性，這種動(dòng)物模型成為研究人類視網(wǎng)膜變性治療措施的有用工具。前期很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)人參皂苷單體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和視神經(jīng)損傷有保護(hù)作用[1-4]。本課題探討人參莖葉總皂苷對(duì)大鼠MNU所致RP的作用及機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

MNU(Sigma公司)、生理鹽水(沈陽(yáng)志鷹制藥廠)、Beclin-1和LC3抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、食用色素(上海獅頭牌)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠30只，100～120 g，雌雄各半，由北京華阜康生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(京)。

1.3 儀器

Morris水迷宮由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，BX60，Japan)，視覺電生理檢測(cè)儀(重慶康華公司，YT 2B)，流式細(xì)胞儀。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

SD大鼠分3組，即空白對(duì)照組、模型組及治療組。模型制備參考文獻(xiàn)[5]，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水后作為對(duì)照。模型組腹腔注射MNU 60 mg/kg；治療組在MNU 60 mg/kg腹腔注射1次，治療組連續(xù)7 d灌胃人參莖葉總皂苷50 mg/kg。

2.2 視覺電生理檢測(cè)

閃光視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)(flashelectroretinogram，ERG) 具體步驟，參照文獻(xiàn)[5]2689-2702。動(dòng)物檢查前暗適應(yīng)過夜，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.5%托吡卡胺滴眼液點(diǎn)眼散瞳，ERG接地電極為針型電極，埋植于大鼠耳垂；參考電極也為針型電極，埋植于大鼠下唇；所有操作均在微弱的紅燈下暗室進(jìn)行。記錄a和b波振幅及峰值期，a波振幅是從基線到a波波谷的電位值，a波峰值期為從光刺激開始至a波的波峰時(shí)間；b波為a波波谷到b波波峰的電位值，b波峰值期為從光刺激開始至b波的波峰時(shí)間，振幅的單位為微伏(μV)，峰值期的單位為毫秒(ms)。

2.3 光鏡形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠，取眼球，固定，石蠟包埋前，剪開角膜，取視網(wǎng)膜。常規(guī)脫水、浸蠟、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，拍照。

2.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮測(cè)試

參照文獻(xiàn)[6]，Morris水迷宮由圓形水池和自動(dòng)錄像儀及分析系統(tǒng)兩部分組成。圓形水池直徑160 cm、高55 cm，內(nèi)壁及底為黑色，站臺(tái)直徑9 cm，高度在20～35 cm之間調(diào)節(jié)。圖像采集卡：可存儲(chǔ)為AVI，圖象分辨率可達(dá)640 pix×480 pix，采集頻率1～25幀/秒可調(diào)。水溫(22±1)℃，水中加入黑色無(wú)毒食用色素，首先進(jìn)行訓(xùn)練，水中不放站臺(tái)。訓(xùn)練后再進(jìn)行2次水池中放有站臺(tái)的訓(xùn)練，站臺(tái)高出水面2 cm。站臺(tái)所在象限有一圓形標(biāo)志物，該標(biāo)志物高出水面1.5 cm。訓(xùn)練中如果在規(guī)定的最長(zhǎng)時(shí)間120 s內(nèi)未到達(dá)站臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引至站臺(tái)，使大鼠在站臺(tái)停留15 s。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)由4次試驗(yàn)組成，大鼠在站臺(tái)停留15 s后進(jìn)行下一輪測(cè)試。120 s內(nèi)未找到站臺(tái)逃避潛伏期則記為120 s，觀察并記錄動(dòng)物找到并爬上站臺(tái)的潛伏期、總時(shí)間、路程、速度。

2.5 檢測(cè)Beclin-1和LC3蛋白的表達(dá)

參考文獻(xiàn)[7]，取視網(wǎng)膜，常規(guī)組織處理方法，剪碎、勻漿、吹散，過濾后，離心。按照說明書，加入一抗、洗滌、二抗，PBS洗滌。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Beclin-1和LC3蛋白的表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 人參莖葉總皂苷對(duì)MNU所誘導(dǎo)大鼠RP的視覺電生理(FERG)和光鏡下形態(tài)學(xué)的影響

各組大鼠視網(wǎng)膜電圖見圖1?？瞻讓?duì)照組均可記錄到典型的ERG波形，a、b波振幅明顯；MNU組大鼠a、b波振幅基本消失，與NC組比較差異顯著；治療組大鼠a、b波振幅出現(xiàn)，與MNU組比較明顯改善，有顯著性差異。結(jié)果提示尼莫地平可拮抗MNU所誘導(dǎo)大鼠RP視功能的下降。

光鏡下形態(tài)學(xué)比較：結(jié)果顯示NC組大鼠視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞排列密集整齊；MNU組大鼠外核層細(xì)胞明顯減少，治療組較模型組比較，外核層細(xì)胞數(shù)目明顯增加，排列緊密。

空白對(duì)照組ERG 模型組ERG 治療組ERG

空白對(duì)照組視網(wǎng)膜HE 模型組視網(wǎng)膜HE 治療組視網(wǎng)膜HE

3.2 治療組對(duì)MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)

模型組潛伏期、總時(shí)間、路程、速度明顯低于空白對(duì)照組，行為學(xué)的變化表明給予MNU后視功能改變；治療組與模型組比較總時(shí)間、潛伏期、路程、速度低于模型組。表明參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性大鼠視功能顯著改善作用，見圖2、表1。

空白對(duì)照組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡 模型組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡 治療組大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡

表2 人參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)

3.3 人參莖葉總皂苷對(duì)MNU所誘導(dǎo)大鼠RP的Beclin-1和LC3蛋白的影響

模型組與對(duì)照組比較，細(xì)胞Beclin-1和LC3陽(yáng)性表達(dá)率增高；治療組與模型組比較Beclin-1 和LC3陽(yáng)性表達(dá)率降低，見圖3。

Beclin-1

空白對(duì)照組 模型組 治療組

LC3

陽(yáng)性表達(dá)率為29.0% 陽(yáng)性表達(dá)率為67.3% 陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%

4 討 論

ERG被認(rèn)為是檢測(cè)由神經(jīng)退行性疾病引起的視覺通路異常的最有用的神經(jīng)生理學(xué)技術(shù)[8]。雖然ERG的確切起源還不清楚，但它似乎是由內(nèi)層產(chǎn)生的中央視網(wǎng)膜(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突)[9]，因此，它反映了視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層異常。本研究顯示，模型組大鼠ERG信號(hào)明顯減弱，表明視錐細(xì)胞感光功能逐漸喪失，與文獻(xiàn)一致[10]。

單次全身給藥MNU可減少外核層厚度，降低ERG反應(yīng)，誘導(dǎo)光受體細(xì)胞死亡，所有這些都是視網(wǎng)膜變性的標(biāo)志，類似于RP的特征癥狀[11]。在此，我們利用MNU誘導(dǎo)的RP大鼠模型與文獻(xiàn)相同，模型組視網(wǎng)膜外核層明顯受損傷。本研究表明人參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性大鼠視功能和形態(tài)學(xué)顯著改善作用。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中定點(diǎn)航行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从硠?dòng)物空間記憶學(xué)習(xí)形成和再獲得的能力?？臻g探索實(shí)驗(yàn)則能夠評(píng)價(jià)動(dòng)物空間定位能力，證明了視力是影響水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的非認(rèn)知能力之一。水迷宮成績(jī)好壞與色素變性嚴(yán)重程度即視網(wǎng)膜光感受器的存活數(shù)量存在相關(guān)性，且室內(nèi)非對(duì)稱環(huán)境對(duì)其也有重要影響。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，對(duì)受視覺功能進(jìn)行評(píng)估[6]50-63。本試驗(yàn)結(jié)果顯示空白對(duì)照組潛伏期、總時(shí)間、路程明顯高于模型組，速度沒有明顯變化，行為學(xué)的變化表明給予MNU后視功能改變但不改變其運(yùn)動(dòng)。治療組與模型組比較潛伏期、總時(shí)間、路程低于模型組，速度沒有明顯變化，表明人參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性大鼠視功能顯著改善作用。綜合視功能和形態(tài)學(xué)結(jié)果，本研究提示人參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)RP大鼠有改善作用。

自噬在神經(jīng)元存活、清除神經(jīng)系統(tǒng)中的衰老細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊蛋白以及保護(hù)神經(jīng)元方面起著關(guān)鍵作用，Beclin-1作為一個(gè)鍵自噬調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)自噬小體的形成[12]。LC3也是自噬的一個(gè)標(biāo)志。自噬主要發(fā)生在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和Muller細(xì)胞，神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡可能與自噬激活有關(guān)[13]。

在MNU誘導(dǎo)的光感受器細(xì)胞死亡過程中，通過抑制PI3K/mTOR通路激活自噬[14]。本研究中我們觀察人參莖葉總皂苷對(duì)AD所致家兔肺Beclin-1和LC3的影響，結(jié)果提示人參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)RP大鼠有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究通過動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)探討人參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)RP大鼠的作用及可能Beclin-1和LC3的影響。結(jié)果顯示，人參莖葉總皂苷對(duì)MNU誘導(dǎo)RP大鼠具有改善作用，并且可能與抑制Beclin-1和LC3有關(guān)。