李 謙，畢愛玲，2，劉德政，畢宏生,2，王興榮,2

0引言

鈣離子(Ca2+)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)分子，生物體內(nèi)多種功能的調(diào)節(jié)都需要Ca2+的參與。Ca2+在調(diào)控細(xì)胞突觸可塑性、發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶等方面也發(fā)揮著重要作用[1]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣信號(hào)從神經(jīng)誘導(dǎo)到神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移和分化的發(fā)展過程中起著重要作用，高度復(fù)雜的神經(jīng)元使得Ca2+的多功能特性得以體現(xiàn)[2]。因此，發(fā)展精確的Ca2+檢測(cè)技術(shù)對(duì)研究神經(jīng)元功能至關(guān)重要。

傳統(tǒng)上，細(xì)胞內(nèi)Ca2+檢測(cè)方法主要是電生理技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)尚存在一些缺點(diǎn)，尤其在長時(shí)間記錄細(xì)胞活動(dòng)方面，電生理記錄使用的電極會(huì)隨著時(shí)間改變位置，稱為電極漂移[3]，這可能導(dǎo)致不同時(shí)間記錄不同的細(xì)胞，極大地影響了信號(hào)記錄。雙光子鈣成像可以更好地解決電生理記錄的主要弱點(diǎn)。隨著顯微成像技術(shù)的不斷進(jìn)步，加上更強(qiáng)大的鈣指示劑的發(fā)現(xiàn)和使用，使得雙光子鈣成像技術(shù)更加成熟、有效[4]。

初級(jí)視皮層(又稱紋狀皮層或者視覺第一區(qū)，即V1區(qū))是哺乳動(dòng)物視覺系統(tǒng)編碼視覺刺激，處理視覺信息的主要區(qū)域，其中視皮層Ⅱ/Ⅲ層主要是輸出投射到更高級(jí)的皮層，Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元的功能特性在視覺信號(hào)通路中起到了關(guān)鍵作用。雖然前人對(duì)初級(jí)視皮層單個(gè)神經(jīng)元的功能特性進(jìn)行了深入的研究，但對(duì)于視皮層神經(jīng)元在編碼視覺刺激，處理視覺信息方面的功能研究，人們知之甚少。綜合以上信息，采用雙光子鈣成像系統(tǒng)檢測(cè)視皮層Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元鈣活動(dòng)的情況，可以更好地檢測(cè)視皮層神經(jīng)元活性變化，為探索視皮層處理和編碼視覺信息的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1雙光子鈣成像技術(shù)的特點(diǎn)

雙光子鈣成像技術(shù)近年來已成為分析神經(jīng)元功能的一種常用方法[5]。目前在體成像技術(shù)缺乏反映單個(gè)細(xì)胞反應(yīng)特性的能力，而雙光子成像檢測(cè)鈣信號(hào)技術(shù)可克服這一限制。使用雙光子顯微鏡進(jìn)行體內(nèi)鈣成像，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)局部區(qū)域中數(shù)百個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)[6]?，F(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于視皮層功能的研究，Ohki等[7]通過Ca2+熒光指示劑標(biāo)記了數(shù)千個(gè)視皮層神經(jīng)元，然后在視皮層下，用雙光子顯微鏡成像了視皮層神經(jīng)元群的活動(dòng)。雙光子顯微鏡系統(tǒng)主要由激光發(fā)射器、光束擴(kuò)展器、二向色鏡、物鏡、探測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成。主要流程是激光發(fā)射器發(fā)出激光， 經(jīng)過光束擴(kuò)展器的調(diào)整被轉(zhuǎn)換成對(duì)稱均勻的平行光束，光束透過二向色鏡，經(jīng)過物鏡匯聚到視皮層目標(biāo)區(qū)域，激發(fā)后的視皮層目標(biāo)區(qū)域發(fā)出相應(yīng)熒光，再通過二向色鏡反射到探測(cè)系統(tǒng)，最終探測(cè)到的信號(hào)由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)收集(圖1[5])。其成像原理是當(dāng)視皮層神經(jīng)元受到視覺刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平會(huì)上升，通過利用Ca2+敏感的熒光指示劑，如GCaMP系列和小分子Ca2+指示劑Fluo-2等，在攝像機(jī)傳感器下可以標(biāo)記相關(guān)活動(dòng)的神經(jīng)元。這種技術(shù)具有穿透性強(qiáng)、空間分辨率高、組織損傷小等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可以在活體動(dòng)物中進(jìn)行長時(shí)程動(dòng)態(tài)檢測(cè)，在視覺神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。

圖1 雙光子鈣成像技術(shù)的裝置示意圖。

這項(xiàng)技術(shù)可在特定細(xì)胞群中表達(dá)熒光蛋白，制備轉(zhuǎn)基因小鼠，被廣泛應(yīng)用于雙光子熒光(TPF)顯微鏡下的活體腦研究。也可通過對(duì)活體小鼠局部注射具有熒光效應(yīng)的標(biāo)記物，用雙光子顯微鏡清晰地對(duì)活體小鼠腦皮質(zhì)局部神經(jīng)元進(jìn)行成像[8]。攜帶Ca2+熒光指示劑的神經(jīng)元可以使雙光子成像系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)多個(gè)神經(jīng)元的峰值活動(dòng)[3, 9]。體內(nèi)雙光子Ca2+成像相對(duì)于多個(gè)電極記錄的優(yōu)勢(shì)在于其空間分辨率更高，可精確地對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行定位，有助于確定其微結(jié)構(gòu)的功能[7]。并且能夠在一個(gè)局部區(qū)域內(nèi)檢測(cè)視皮層神經(jīng)元的功能結(jié)構(gòu)，為大腦皮層的實(shí)驗(yàn)研究開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。

2雙光子鈣成像技術(shù)在視皮層Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元功能研究中的應(yīng)用

2.1雙光子鈣成像技術(shù)在研究視皮層Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元纖維投射的連接性與功能性的應(yīng)用神經(jīng)元連接是大腦信息處理的前提，而視皮層神經(jīng)元連接性與功能性之間的關(guān)系是處理視覺信息，理解視覺通路的基礎(chǔ)。有研究者通過電生理技術(shù)記錄了視皮層上多個(gè)熒光標(biāo)記神經(jīng)元的突觸連接，表明了相鄰錐體神經(jīng)元之間的突觸連接是不均勻的，取決于細(xì)胞類型、電生理特性等因素[10-11]。事實(shí)上，即使在分布相對(duì)均勻的視皮層神經(jīng)元群中，連接性也不是均勻分布的[12]。雖然這種非隨機(jī)連接增加了功能相似的神經(jīng)元形成突觸的可能性，但神經(jīng)元突觸在局部皮層回路中的功能特性尚未確定。為了探索連接強(qiáng)度與神經(jīng)元功能之間的關(guān)系，Ko等[13]在麻醉小鼠視皮層中注射鈣熒光指示劑OGB-1 AM和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物SR101，然后在呈現(xiàn)漂移光柵和自然場(chǎng)景時(shí)，使用雙光子鈣成像在體檢測(cè)技術(shù)記錄了小鼠視皮層Ⅱ/Ⅲ層錐體神經(jīng)元中與尖峰相關(guān)的體細(xì)胞鈣信號(hào)，在研究中對(duì)小鼠V1區(qū)局部連接的功能特異性進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，相鄰錐體神經(jīng)元之間的連接不是隨機(jī)的，視覺刺激驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)元更有可能彼此連接，這種可能性隨著它們的反應(yīng)相似程度的增加而增加。當(dāng)比較自然場(chǎng)景感官輸入的反應(yīng)時(shí)，連接和功能之間的關(guān)系相對(duì)人工漂移光柵刺激更強(qiáng)。Cossell等[14]同樣通過應(yīng)用體內(nèi)雙光子鈣成像和體外全細(xì)胞記錄揭示了小鼠初級(jí)視皮層Ⅱ/Ⅲ層錐體神經(jīng)元之間的連接強(qiáng)度遵從一個(gè)簡單的規(guī)律:反應(yīng)高度相關(guān)的神經(jīng)元形成強(qiáng)大的連接，而反應(yīng)不相關(guān)或負(fù)相關(guān)的神經(jīng)元連接很少，只有微弱的連接。

在哺乳動(dòng)物視覺系統(tǒng)中，外界視覺信息到達(dá)V1區(qū)，進(jìn)一步投射到更高層次的視覺皮層區(qū)域[15-16]。其中，前外側(cè)視覺區(qū)(AL)和后內(nèi)側(cè)視覺區(qū)(PM)是V1神經(jīng)元投射的兩個(gè)主要靶區(qū)。在視皮層Ⅱ/Ⅲ層，錐體神經(jīng)元優(yōu)先接受共同突觸輸入的神經(jīng)元[17]，從而優(yōu)先對(duì)外界視覺刺激做出反應(yīng)。然而，對(duì)于V1神經(jīng)元的長期投射靶區(qū)與它們的局部連通性和功能特性之間的關(guān)系，我們知之甚少。為了研究AL和PM投射神經(jīng)元的特異性連接與它們的視覺反應(yīng)特性之間的關(guān)系，Kim等[18]使用雙光子鈣成像技術(shù)記錄了清醒小鼠視皮層Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元的活動(dòng)，通過觀察投射到AL和PM區(qū)域的V1神經(jīng)元的局部連接，發(fā)現(xiàn)投射到不同目標(biāo)區(qū)域的神經(jīng)元之間的連接很少見，而且明顯少于投射到相同目標(biāo)區(qū)域或隨機(jī)取樣神經(jīng)元之間的連接。Mark等[19]在清醒小鼠上利用雙光子鈣成像來比較V1區(qū)和兩個(gè)下游靶區(qū)(AL和PM)的視覺反應(yīng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)區(qū)域幾乎完全沒有重疊的刺激偏好，AL神經(jīng)元對(duì)低空間頻率，高時(shí)間頻率或快速移動(dòng)的刺激反應(yīng)最好，而PM神經(jīng)元對(duì)高空間頻率，低時(shí)間頻率或緩慢移動(dòng)的刺激反應(yīng)最好。相比之下，V1區(qū)域是這兩個(gè)區(qū)域的主要輸入源，V1區(qū)域的神經(jīng)元對(duì)廣泛的頻率和速度非常敏感。此外，PM、AL和V1的神經(jīng)元群體對(duì)刺激方向具有相似的定向選擇性。這些結(jié)果表明，較高的視覺區(qū)域AL和PM對(duì)處理不同類型的視覺信息具有很強(qiáng)的特異性。雙光子鈣成像技術(shù)的應(yīng)用可以用來揭示不同細(xì)胞類型和其他皮質(zhì)層區(qū)域連接的功能偏差，這對(duì)于理解視覺通路的功能機(jī)制是至關(guān)重要的。

2.2雙光子鈣成像技術(shù)在研究不同視覺刺激對(duì)視皮層功能影響中的應(yīng)用當(dāng)受到靜止或運(yùn)動(dòng)模式的視覺刺激時(shí)，視皮層的神經(jīng)元對(duì)視覺刺激的不同基本特征有選擇性的反應(yīng)，這些反應(yīng)可以通過其接受域的興奮區(qū)和抑制區(qū)的排列來表達(dá)。神經(jīng)元對(duì)感官刺激的反應(yīng)特性已被用來識(shí)別它們的接受域，并在功能上映射到感官系統(tǒng)。在初級(jí)視皮層中，大多數(shù)神經(jīng)元對(duì)視覺刺激的特定方向和空間頻率具有選擇性。Ayzenshtat等[20]通過對(duì)小鼠初級(jí)視皮層Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元群進(jìn)行雙光子鈣成像表征了神經(jīng)元對(duì)不同方向和空間頻率的響應(yīng)特性，發(fā)現(xiàn)小鼠初級(jí)視皮層神經(jīng)元的定向選擇性與刺激的空間頻率高度相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠視皮層Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元的接受域在空間上是不對(duì)稱的，視覺系統(tǒng)可以利用這種不對(duì)稱的特性來編碼自然場(chǎng)景。

猴V1區(qū)的大部分神經(jīng)元對(duì)特定范圍的條形和光柵能做出反應(yīng)，并對(duì)刺激的方向有著調(diào)節(jié)作用。V1神經(jīng)元的偏好取向和調(diào)諧強(qiáng)度各不相同，對(duì)于V1神經(jīng)元是如何通過方向調(diào)節(jié)的強(qiáng)度來排列的，以及調(diào)節(jié)強(qiáng)度的神經(jīng)元排列是否與方向偏好有關(guān)，仍然存在爭議。Ikezoe等[21]在獼猴V1區(qū)進(jìn)行了雙光子鈣成像，以檢測(cè)單細(xì)胞水平上局部皮層區(qū)域定向調(diào)節(jié)的能力。在視皮層Ⅱ/Ⅲ層的神經(jīng)元群中分別記錄了帶有鈣敏感染料的單個(gè)神經(jīng)元的熒光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)Ⅱ/Ⅲ層接近的V1神經(jīng)元具有相同的定向調(diào)節(jié)強(qiáng)度和定向偏好，方向調(diào)優(yōu)強(qiáng)度和方向偏好的函數(shù)映射是相互關(guān)聯(lián)的。

2.3雙光子鈣成像技術(shù)在研究視皮層經(jīng)驗(yàn)依賴可塑性的應(yīng)用視覺經(jīng)驗(yàn)是視皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能發(fā)育的重要基礎(chǔ)。隨著視覺經(jīng)驗(yàn)的改變，視皮層神經(jīng)元產(chǎn)生與之相適應(yīng)的改變，我們稱之為經(jīng)驗(yàn)依賴可塑性。Hubel等[22]通過研究單眼剝奪對(duì)貓視覺皮層功能的影響，證明了視皮層經(jīng)驗(yàn)依賴可塑性存在一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期[22]。在視皮層發(fā)育的這個(gè)關(guān)鍵時(shí)期中，視覺經(jīng)驗(yàn)?zāi)承┏潭鹊母淖兛梢哉T發(fā)視皮層可塑性的顯著變化。視皮層神經(jīng)元對(duì)視覺刺激的基本特征有選擇性的反應(yīng)，這些響應(yīng)特性是可塑的，可以通過視覺輸入來塑造。目前還不清楚視覺輸入的哪一個(gè)特定方面有助于定向選擇性的可塑性。Wang等[23]利用雙光子顯微鏡研究了成年小鼠視皮層定向選擇性隨視覺經(jīng)驗(yàn)的變化規(guī)律。有研究者進(jìn)一步研究了定向受限視覺經(jīng)驗(yàn)對(duì)大鼠視覺皮質(zhì)反應(yīng)特性的影響，證明了長期暴露于單一方向可以改變定向偏好，這種定向受限依賴視皮層經(jīng)驗(yàn)可塑性[24]。Kreile等[25]將戴有條帶狀的圓柱形透鏡的老鼠飼養(yǎng)在有條帶狀的籠子里，條帶圖案的方向與透鏡條帶方向相同。在條帶飼養(yǎng)后，用雙光子鈣成像技術(shù)測(cè)定視皮層神經(jīng)元的定向偏好。這使得我們能夠在給定視野下對(duì)所有神經(jīng)元進(jìn)行采樣，包括無反應(yīng)的神經(jīng)元，從而克服了細(xì)胞外電生理記錄的基本限制。條帶飼養(yǎng)3wk后，在小鼠視覺皮層Ⅱ/Ⅲ層觀察到條帶飼養(yǎng)后對(duì)定向的視覺經(jīng)驗(yàn)刺激反應(yīng)明顯增強(qiáng)，響應(yīng)性神經(jīng)元整體比例略有下降，但這種效應(yīng)在Ⅱ/Ⅲ層隨深度變化:響應(yīng)性在Ⅱ/Ⅲ層的最上層下降，但在Ⅱ/Ⅲ層的下層保持不變。同時(shí)，Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元的定向傾向明顯向經(jīng)驗(yàn)定向轉(zhuǎn)移，說明該神經(jīng)元群體的定向效果具有較大的指導(dǎo)意義。因此，對(duì)于小鼠視覺皮層神經(jīng)元，視覺環(huán)境可以作為一種指示信號(hào)，以自適應(yīng)的方式改變單個(gè)神經(jīng)元的定向偏好，從而改變了初級(jí)視覺皮層的神經(jīng)元反應(yīng)特性，證明了指導(dǎo)機(jī)制有助于經(jīng)驗(yàn)依賴的可塑性。

3展望

近年來，熒光成像技術(shù)在研究神經(jīng)元方面變得越來越重要。隨著基因編碼的鈣指示劑(GECIs)光學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展，雙光子顯微鏡在模型動(dòng)物視皮層做鈣成像研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展。這些研究將不僅局限于視皮層總體細(xì)胞功能的研究，還可研究某一特殊類型神經(jīng)元群體的功能。例如Carrillo-Reid等[26]使用體內(nèi)雙光子鈣成像技術(shù)記錄了清醒小鼠在有無視覺刺激的情況下初級(jí)視覺皮質(zhì)神經(jīng)元群的活動(dòng)。Sohya等[27]利用雙光子鈣成像技術(shù)證明了視皮層神經(jīng)元GABA在視覺刺激定向選擇性的形成過程中發(fā)揮重要作用。研究神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的可塑性是體內(nèi)雙光子鈣成像技術(shù)的一個(gè)很有前景的應(yīng)用。例如，形覺剝奪實(shí)驗(yàn)中利用雙光子鈣成像技術(shù)證明了單側(cè)眼瞼閉合對(duì)小鼠視皮層神經(jīng)元可塑性有顯著影響[25，28]。雙光子熒光顯微鏡在活體成像技術(shù)的發(fā)展，也極大地促進(jìn)了視皮層神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的研究和發(fā)展。

相對(duì)于傳統(tǒng)的電生理學(xué)技術(shù)，鈣信號(hào)在體檢測(cè)技術(shù)能夠長期觀察相同細(xì)胞，更大數(shù)量的細(xì)胞群，具有實(shí)時(shí)、高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究前沿，它還將推動(dòng)光學(xué)成像技術(shù)在視皮層功能研究的快速發(fā)展。