路 璐, 李 歡

0引言

miRNA為短鏈的非編碼內(nèi)源性保守的微小RNA分子，其通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程及調(diào)控信號通路的活性，在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1]。miR-221在機體多種腫瘤中均出現(xiàn)表達失調(diào)，其在糖尿病引起的疾病中也有重要作用[2]，但是其在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能及作用機制研究甚少。本研究擬以高糖誘導的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞HRCECs為研究對象，檢測其中miR-221、p53、MDM2的表達，觀察過表達miR-221、抑制miR-221、過表達MDM2對高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的影響，揭示miR-221促進高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的機制與P53/MDM2信號通路有關。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞HRCECs購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；Trizol液購自上海恪敏生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購自北京宜科思源科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京艾然生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。P53抗體購自上海研謹生物科技有限公司；MDM2抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞HRCECs用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染與分組將正常培養(yǎng)的HRCECs細胞分為NG組、HG組、HG+miR-NC組、HG+miR-221組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-221組、HG+miR-221+pcDNA 3.1組、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組。各組細胞的處理方法分別為：NG組：用5mmol/L的葡萄糖處理48h的HRCECs細胞；HG組：用30mmol/L的葡萄糖處理48h的HRCECs細胞；將miR-NC、miR-221 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-221、miR-221 mimics+pcDNA 3.1、miR-221 mimics+pcDNA 3.1-MDM2按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書的操作步驟轉(zhuǎn)染至HRCECs細胞，轉(zhuǎn)染5h后，棄去培養(yǎng)液更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，用qRT-PCR法確認轉(zhuǎn)染效率達到要求。轉(zhuǎn)染成功后用30mmol/L的葡萄糖處理培養(yǎng)48h，分別標記為HG+miR-NC組、HG+miR-221組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-221組、HG+miR-221+pcDNA 3.1組、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組，用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3 qRT-PCR法檢測細胞中miR-221、p53、MDM2的表達Trizol法提取對數(shù)生長期的細胞樣本總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計進行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說明書進行，合成模板鏈cDNA。按照反應體系進行，反應結(jié)束后通過分析Ct值，以U6、β-actin為內(nèi)參，計算定量結(jié)果，以2-△△Ct法測定miR-221、p53、MDM2的相對表達水平。引物信息(5’-3’)：miR-221上游引物ACACTCCAGCTGGGGAAACCCAGCAGACAA，下游引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGT；p53上游引物TGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGAC，下游引物CTGACGCACACCTATTGCAAGCAAGGGTTC；MDM2上游引物CACCTCACAGATTCCAGCTT，下游引物CGCCAAACAAATCTCCTAGA；β-actin上游引物GGACTTCGAGCAAGAGATGG，下游引物AGCACTGTGTTGGCGTACAG；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4 Western blot實驗檢測細胞中p53、MDM2的蛋白表達將對數(shù)期細胞進行冰上蛋白裂解1h，提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的濃度。以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴變性5min，離心取上清，取60μg目的蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳。然后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗滌，4℃條件下，將封閉后的PVDF膜放入一抗(1∶1000稀釋的P53抗體、MDM2抗體)中反應過夜，以封閉液洗膜3次，每次5min，再在37℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入二抗(1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體)中反應2h。于暗室內(nèi)ECL試劑盒顯影曝光：滴加化學發(fā)光劑顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One 4.62圖像分析軟件進行條帶灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式細胞術實驗檢測細胞凋亡將1.2.2各轉(zhuǎn)染組細胞，用500μL的Binding Buffer懸浮細胞，分別加入5μL的Annexin V-/FITC避光反應20min后再加入5μL的PI避光反應20min，用300目銅篩過濾，最后在1h內(nèi)上流式細胞儀結(jié)束檢測。細胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

2結(jié)果

2.1 miR-221在高糖誘導的HRCECs細胞中的表達結(jié)果如圖1所示，與NG組相比，HG組細胞中miR-221表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=32.863，P<0.05)。

圖1 miR-221在高糖誘導的HRCECs細胞中的表達 aP<0.05 vs NG組。

2.2 p53和MDM2在高糖誘導的HRCECs細胞中的表達結(jié)果如圖2所示，與NG組相比，HG組細胞中p53的mRNA和蛋白表達均顯著升高(t=15.274、16.127，均P<0.05)，MDM2的mRNA和蛋白表達均顯著降低(t=22.472、16.994，均P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。

圖2 p53和MDM2在高糖誘導的HRCECs細胞中的表達 A：p53、MDM2在高糖誘導的HRCECs細胞的mRAN的表達；B：p53、MDM2在高糖誘導的HRCECs細胞的蛋白表達。aP<0.05 vs NG組。

2.3過表達miR-221對高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的影響結(jié)果如圖3所示，NG組、HG組、HG+miR-NC組、HG+miR-221組細胞凋亡率比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=29.506，P<0.01)。與NG組相比，HG組細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-221組細胞的凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖3 過表達miR-221對高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的影響 aP<0.05 vs NG組，cP<0.05 vs HG+miR-NC組。

2.4抑制miR-221對高糖誘導的HRCECs細胞中p53、MDM2表達及凋亡的影響結(jié)果如圖4所示，HG組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-221組細胞中p53 mRNA和蛋白表達、MDM2 mRNA和蛋白表達、凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=707.353、211.787、372.761、334.887、170.664，均P<0.01)。與HG+anti-miR-NC組相比，HG+anti-miR-221組細胞中p53的mRNA和蛋白表達均顯著降低，MDM2的mRNA和蛋白表達均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.5過表達MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的影響結(jié)果如圖5所示，HG組、HG+miR-221+pcDNA 3.1組、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組細胞凋亡率、p53蛋白表達、MDM2蛋白表達，差異均有統(tǒng)計學意義(F=202.442、347.115、621.257，均P<0.01)。與HG組相比，HG+miR-221+pcDNA 3.1組細胞凋亡率顯著升高，p53蛋白表達顯著升高，MDM2蛋白表達顯著降低，HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組細胞凋亡率顯著降低，p53蛋白表達顯著降低，MDM2蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與HG+miR-221+pcDNA 3.1組相比，HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組細胞凋亡率顯著降低，p53蛋白表達顯著降低，MDM2蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖5 過表達MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的影響 A：過表達MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的影響；B：過表達MDM2對抑制miR-221的抗高糖誘導的HRCECs細胞中p53、MDM2蛋白表達的影響。aP<0.05 vs HG組,cP<0.05 vs HG+miR-221+pcDNA 3.1組。

3討論

miRNA參與人類機體的多種疾病的發(fā)生發(fā)展，其中包括糖尿病[3-4]。由于miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡十分復雜，因此其在疾病中的作用機制成為研究的熱點和難點。據(jù)報道，miR-221在糖尿病腎病、糖尿病心臟疾病中均出現(xiàn)異常表達[5-6]。Daniel等[7]報道，miR-221和miR-222在糖尿病小鼠血管平滑肌細胞中的表達上調(diào)，促進糖尿病小鼠的血管內(nèi)膜增厚，而抑制上調(diào)的miR-221和miR-222可有效預防糖尿病心血管疾病，其可能與細胞外信號應答激酶-1/2(ERK-1/2)和p27Kip1有關。Liu等[8]在研究中報道，miR-221在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中的表達水平明顯的上調(diào)，并與患者的總體存活率具有顯著的相關性，更重要的是，miR-221的診斷效率明顯的高于Ang Ⅱ、VEGF，揭示血清miR-221作為潛在的生物標志物不僅與T2DM患者DR的發(fā)生有關，而且與DR的進展有關。遺憾的是，沒有繼續(xù)進行miR-221在糖尿病視網(wǎng)膜病變的體外研究。本研究用高糖誘導了HRCECs建立糖尿病視網(wǎng)膜病變的體外研究細胞模型，檢測了其中miR-221的表達水平發(fā)現(xiàn)，miR-221高表達，這與Liu等[8]在患者血清中的檢測結(jié)果相呼應；進一步研究，通過流式細胞術檢測過表達miR-221在高糖誘導的HRCECs細胞中的作用發(fā)現(xiàn)，過表達miR-221后，高糖誘導的HRCECs細胞的凋亡率上調(diào)更嚴重，并上調(diào)p53、下調(diào)MDM2， 抑制miR-221則起相反的作用抑制凋亡作用，這說明miR-221在高糖誘導的HRCECs凋亡中具有促進作用，提示miR-221具有促進糖尿病視網(wǎng)膜病變的惡性進展的作用，推測可能與p53/MDM2通路相關，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷和治療提供新的靶點。

p53為一種可誘導細胞凋亡核磷酸蛋白，其在糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)大量積累[9-10]。MDM2是一種負向調(diào)節(jié)p53的下游因子，其可通過與p53結(jié)合引起其泛素化降解，從而抑制p53引起的凋亡級聯(lián)反應[11-13]。有研究報道，MDM2過度表達時，可抑制p53的功能[14]。郭承偉等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，在糖尿病視神經(jīng)病變大鼠模型中，p53的表達明顯升高，MDM2的表達明顯降低，大黃蟲丸治療后，p53、MDM2的表達得到平衡，可見，p53/MDM2通路在糖尿病視神經(jīng)病變中的關鍵作用。本研究檢測了高糖誘導了HRCECs細胞中p53、MDM2的表達發(fā)現(xiàn)，p53的表達升高，MDM2的表達降低，二者呈明顯的負相關，這與前人的實驗結(jié)果均相一致；進一步研究發(fā)現(xiàn)，p53、MDM2的表達水平受miR-221的調(diào)控，這為p53/MDM2信號通路的調(diào)控機制研究提供參考依據(jù)；深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達MDM2可逆轉(zhuǎn)抑制miR-221的抗高糖誘導的HRCECs細胞凋亡，這說明不僅miR-221可調(diào)控p53/MDM2信號通路，相反，MDM2也可反向調(diào)控miR-221在高糖誘導的HRCECs細胞的功能。

綜上所述，miR-221可促進高糖誘導的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡，其作用機制與調(diào)控p53/MDM2信號通路調(diào)控有關，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供新靶點。