鐘家棟, 孫 斌, 趙玉曉, 馬鑫鈺, 張竟月

(1. 中國計(jì)量大學(xué), 浙江 杭州 310018; 2. 中國計(jì)量科學(xué)研究院, 北京 100029)

1 引 言

在蛋白質(zhì)工程、基因測序、新藥物研制、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等各種類型的實(shí)驗(yàn)研究活動(dòng)中,都需要對數(shù)以萬計(jì)的微量級液體容量的酶類、添加劑、化合物等試劑進(jìn)行在線分配轉(zhuǎn)移操作[1,2]。另外,目前生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)使用的液體容量呈不斷減小的趨勢,在DNA分析、基因重組研究中,需要的液體容量都在μL級[3],微量液體容量的操作精度對實(shí)驗(yàn)效果的影響不斷增大[4]。這要求對微量液體重復(fù)性精度的計(jì)量技術(shù)有非常精確的檢測方法。因此,國際計(jì)量局技術(shù)咨詢委員會(CCM.FF)已經(jīng)將超微量容量校準(zhǔn)列入國際關(guān)鍵對比(Key Comparison)計(jì)劃,以此來到提高對微量液體精確計(jì)量的可靠性[5]。目前實(shí)驗(yàn)室常用的檢測微量液體容量的方法為靜力稱重法,該法在1 μL容量的檢測點(diǎn)重復(fù)性可達(dá)1.85%,精度達(dá)到2.18%[6～8]。 該檢測系統(tǒng)對檢測環(huán)境有著非常嚴(yán)格的要求,工作環(huán)境溫度需要在1℃以內(nèi),工作臺面需要防震防塵,設(shè)備儀器價(jià)格昂貴,因此該方法不適合在線檢測。文獻(xiàn)[9]提出了一種新型電容式非接觸式傳感器檢測微量液體容量法,重復(fù)性達(dá)到0.13%,該法同樣對環(huán)境及操作有嚴(yán)格要求,若有檢測液殘留在電極上,將引起電容介電常數(shù)的變化,嚴(yán)重影響精度[9]。

針對適用于微量液體容量的在線檢測,在ISO 8655-7中提出了一種基于Lambert-Beer定律的光度參比法,該方法在紫外可見分光光度計(jì)的工作曲線內(nèi),對微量液體容量進(jìn)行了檢測,該法在1 μL檢測點(diǎn)的精度為6.09%,重復(fù)性為1.31%。該法中的體積參照標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配置的標(biāo)準(zhǔn)體積比,此體積比通過標(biāo)準(zhǔn)一級玻璃量器配制得到,但此參照標(biāo)準(zhǔn)存在參照點(diǎn)單一、線性度偏差、配制過程復(fù)雜等實(shí)際問題[10,11]。

經(jīng)過對此法進(jìn)行深入的研究以后,提出了一種建立該法中新的參照標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定的方法。本文研究的方法通過實(shí)驗(yàn)室靜力稱重法代替標(biāo)準(zhǔn)液法重新標(biāo)定參照標(biāo)準(zhǔn),將參照標(biāo)準(zhǔn)由點(diǎn)擴(kuò)展到線。通過實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析,新研究的標(biāo)定方法提高了對微量液體容量的檢測精度。

2 光學(xué)法原理

光度參比法依據(jù)Lambert-Beer定律,當(dāng)一束光通過單一 、非散射的均勻吸光物質(zhì)溶液時(shí),溶液的吸光度A與摩爾吸光系數(shù)ε、溶液濃度c和光程b的乘積成正比,吸光度公式關(guān)系為:

(1)

式中I0和I1分別為入射光強(qiáng)度和出射光絕對光強(qiáng)度。

Lambert-Beer定律有2個(gè)重要的適用條件,首先要求吸光度A的值在0.2～0.8之間,在該范圍外的吸光度變化線性度差,其次樣品濃度需要控制在0.01 mol/L以下,濃度高時(shí),吸光粒子間的平均距離減小,受粒子間電荷分布相互作用的影響,吸光粒子的摩爾吸收系數(shù)發(fā)生改變,導(dǎo)致偏離定律。

為了消去摩爾吸光系數(shù)和光程帶來的系統(tǒng)誤差,使吸光度僅與溶質(zhì)濃度有關(guān),實(shí)際檢測時(shí)實(shí)驗(yàn)室選用在2種波長有吸收峰的溶液作為雙波長吸收液,通過2者的比值同時(shí)約去參數(shù)摩爾吸光系數(shù)和光程。兩種吸光液體的選擇要求互在彼此的波長段內(nèi)吸光度值為0,由式(1)可知約去摩爾吸光系數(shù)和光程后,吸光度僅與濃度成正比,而濃度又與溶質(zhì)體積成正比,因此,可由吸光度的變化測量加入微量溶質(zhì)的體積。

假設(shè)液體1在波長1處有吸收峰,液體2在波長2處有吸收峰。在實(shí)際檢測之前先按照精確比例配制兩種液體的混合液,使該混合液在波長1和波長2處同時(shí)有吸收值。將此混合液作為標(biāo)準(zhǔn)參照液,與待測液進(jìn)行對比后計(jì)算待測液內(nèi)的溶質(zhì)體積。

2種液體按照一定比例混合后制成的標(biāo)準(zhǔn)液在波長1處、波長2處的吸光度和混合稀釋比如式(2)、式(3)和式(4)所示。其中AS1、AS2為混合液在波長1和2處的吸光度；ε1、ε2為波長1和2處的摩爾吸光系數(shù)；c1、c2為混合前2種液體中吸光物質(zhì)的濃度；R為混合稀釋比例；V1,V2分別是2種液體的混合前體積。

AS1=ε1c1RL0

(2)

AS2=ε2c2(1-R)L0

(3)

(4)

將式(2)和式(3)相除得到雙波長吸光度比值:

(5)

在實(shí)驗(yàn)室測得AS1,AS2,R以后其數(shù)值作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)帶到現(xiàn)場檢測使用。在線檢測時(shí),首先在比色皿中加入一標(biāo)準(zhǔn)體積VD的液體2,并測量在液體2處有吸收峰的液體吸光度AD1,AD2,由于AD2的實(shí)際測量值會在分光光度計(jì)的不確定度范圍內(nèi)波動(dòng),所以將做AD1作為吸光度相對零點(diǎn),AD2和相對零點(diǎn)做差后得:

AD2-AD1=ε2c2L′

(6)

式中L′為比色皿中的光程距離。

使用待檢測移液器向比色皿中移入體積為VU(檢測點(diǎn))的液體1,同樣可獲得相對吸光度值:

(7)

整理式(2)、式(3)、式(4)、式(6)和式(7)得到:

(8)

光度參比法不受比色皿及環(huán)境因素差異的影響,適合現(xiàn)場檢測環(huán)境下使用。該法的過程中最重要的一步是制備標(biāo)準(zhǔn)比例的標(biāo)準(zhǔn)液,在過去實(shí)現(xiàn)主要通過一級標(biāo)準(zhǔn)玻璃量器來實(shí)現(xiàn)其配比,以此實(shí)現(xiàn)高精度對低精度的檢測。但該法存在些許不足,第一是該法配置的標(biāo)準(zhǔn)液只是一個(gè)配比單點(diǎn),雖然理論上濃度與吸光度是完全線性的,但實(shí)際上不同次測量下存在一定波動(dòng),只用單點(diǎn)這個(gè)波動(dòng)的誤差會對結(jié)果造成全額誤差;第二是該法對標(biāo)準(zhǔn)液的配置較為繁瑣,且若使用液體的表面張力較大,則一級標(biāo)準(zhǔn)玻璃內(nèi)殘余液也相對較多,配置的標(biāo)準(zhǔn)液體積比也并非可靠。

3 擬合參值法標(biāo)定原理

靜力法通常只在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用,通過測液體的質(zhì)量和密度來計(jì)算液體體積,精度可達(dá)到10-5級,高于移液器精度要求兩個(gè)數(shù)量級,滿足精度要求。光度參比法系統(tǒng)通過靜力法標(biāo)定可使在線測量結(jié)果更加接近實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果。

(9)

通過式(8)和式(9)可得:

(10)

式中AU,AD1,AD2由分光光度計(jì)測得;VU,VD由式(11)靜力法通過質(zhì)量與密度計(jì)算得到:

(11)

將各個(gè)檢測點(diǎn)的K值為:

(12)

式中K1,K10,K20,K30,…,K100分別為對應(yīng)μL級液體的配比點(diǎn);n=1,2,…,100,對此直線進(jìn)行總體最小二乘擬合,得:

K=a(VK)+m

(13)

式中a、m為最小二乘法待估參數(shù),則誤差方程為:

νK=[1VK][αm]-K

(14)

其中,νk=[νK1νK10νK20…νK100]T;K=[K1K10K20…K100]T;VK=[VK1VK10VK20…VK100]T。

在此約束條件下,其最小二乘解為:

(15)

則每一測量點(diǎn)的對應(yīng)計(jì)算關(guān)系為:

Kν=a(ν)+m

(16)

在現(xiàn)場檢測中,直接使用Kν,如式(17)所示。

(17)

此法與前法相比采用多點(diǎn)值計(jì)算,消除了不確定性誤差,且操作相對于標(biāo)準(zhǔn)液配比法更加簡易,但對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的要求較高,適合在實(shí)驗(yàn)室同時(shí)具備高精度天平和密度計(jì)的情況下使用。

4 實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析

光譜儀是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要的數(shù)據(jù)采集部分,其數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度直接影響計(jì)算結(jié)果。傳統(tǒng)的光譜儀器,其龐大的體積,高昂的價(jià)格幾乎將此類儀器設(shè)備限制在實(shí)驗(yàn)室中[12]。經(jīng)典非對稱型Czerny-Turner光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)(圖1)的發(fā)展使光譜儀走入小型化,使得光譜儀可以離開實(shí)驗(yàn)室,使用在在線檢測系統(tǒng)中。圖2為Czerny- Turner光學(xué)系統(tǒng)實(shí)物圖,圖3為Czerny-Turner光學(xué)光譜圖。

圖1 Czerny-Turner光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Czerny-Turner Structure diagram of optical system

圖2 Czerny-Turner光學(xué)系統(tǒng)實(shí)物圖Fig.2 Czerny-Turner Optical system structure object chart

圖3 Czerny-Turner光學(xué)光譜圖Fig.3 Czerny-Turner Optical spectrogram

實(shí)驗(yàn)采用的光譜儀使用10 W的定功率鎢光燈。傳感器采用線陣型CCD TCD1304,其測量范圍大、頻率響應(yīng)高,實(shí)時(shí)傳輸光電變換信號和自掃描速度快等優(yōu)點(diǎn)而尤其適合光譜分析類精密測量領(lǐng)域,光譜儀的性能指標(biāo)為波長分辨率0.5 nm,重復(fù)性0.5%,該型號的CCD可將吸光度變化控制在0.005以內(nèi),根據(jù)式(8)造成的系統(tǒng)誤差為1%。

光學(xué)雙波長法選用對520 nm和730 nm有吸收峰的2種液體作為原液和稀釋液,所采用的溶液分別為Ponceau S水溶液和CuCl2·2H2O與EDTA、NaOH混合水溶液。具體濃度配置根據(jù)移液器檢定點(diǎn)的大小變化而變化,最終需求是要將混合液的吸收度保持在0.2到0.8之間以滿足Lambert-Beer定律的線性要求。

檢測量程100 μL的移液器時(shí),溶液配制步驟為:將0.476 g的Ponceau S加入水,配制成1 000 ml 溶液,作為原液;將1.12 g CuCl2·2H2O和3.74 g EDTA、13 mL的1 mol/L的NaOH溶液混合,加入水至1 000 mL,作為稀釋液;首先需要對此2種液體的值進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)室采用的天平型號為MXP26PC,稱重范圍0～22 g,分辨率為0.001 mg。采用的密度計(jì)為Anton Paar 的DMA 5 000 U型管震蕩密度計(jì),測量分辨率為1×10-6g/cm3。

標(biāo)準(zhǔn)溫度20 ℃時(shí)移液裝置的實(shí)際容量的體積計(jì)算式為:

(18)

式中:m為被檢移液裝置所排出的蒸餾水表觀質(zhì)量;ρb為砝碼密度;ρa(bǔ)為檢定時(shí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的空氣密度。

由表1可知實(shí)際情況下K值并非固定。使用平均K值作為擬合K值法的K,將2種方法的K值數(shù)據(jù)作為檢測使用與靜力稱量法比較,如圖4所示。

表1 K值實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.1 K value experimental data

圖4為100 μL點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液法和擬合參值法對比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),由圖4可得出:在100 μL檢測點(diǎn),以靜力稱重法為理論結(jié)果,靜力稱重法的重復(fù)性為0.15%。標(biāo)準(zhǔn)液法的重復(fù)性為0.98%,擬合參值法重復(fù)性為0.53%;標(biāo)準(zhǔn)液法的測量偏差為0.902%,擬合參值法的測量偏差為0.310%。在JJG 646—2006中100 μL的重復(fù)性允差為1%,測量偏差允差為2%。擬合參值法在滿足規(guī)程要求的情況下重復(fù)性和測量偏差都進(jìn)一步提高。

圖4 100 μL點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液法和擬合參值法對比實(shí)驗(yàn)Fig.4 Contrast experiment of 100 μL point standard liquid method and fitting parameter method

同樣,在10 μL點(diǎn)下對2種方法進(jìn)行比較,如圖5所示。由圖5可得出:在10 μL檢測點(diǎn),以靜力稱重法為理論結(jié)果,靜力稱重法的重復(fù)性為1.60%。標(biāo)準(zhǔn)液法的重復(fù)性為1.83%,擬合參值法重復(fù)性為1.30%;標(biāo)準(zhǔn)液法的測量偏差為4.85%,擬合參值法的測量偏差為2.014%。在JJG 646—2006中10 μL的重復(fù)性允差為4%,測量偏差允差為8%。同樣擬合參值法在滿足規(guī)程要求的情況下重復(fù)性和測量偏差都進(jìn)一步提高。

圖5 10 μL點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液法和擬合參值法對比實(shí)驗(yàn)Fig.5 Contrast experiment of 10 μL point standard liquid method and fitting parameter method

5 結(jié) 論

通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到以下結(jié)論:1)通過線陣CCD的光學(xué)系統(tǒng)與Ponceau S溶液的實(shí)驗(yàn)對該法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,證明了該新標(biāo)定方法可以代替原有的標(biāo)準(zhǔn)液法進(jìn)行標(biāo)定。2)將靜力稱重法與光學(xué)測量法結(jié)合后,采用新的標(biāo)定方法,在100 μL測量點(diǎn)可將精確度由0.902%提高到0.310%;在10 μL檢測點(diǎn)可將精度由4.85%提高到2.014%。3)新標(biāo)定方法將檢測點(diǎn)的參照標(biāo)準(zhǔn)由點(diǎn)拓展到線,實(shí)現(xiàn)了微量液體容量每一個(gè)檢測點(diǎn)都有對應(yīng)的參照標(biāo)準(zhǔn),通過該原理提高了系統(tǒng)重復(fù)性,在100 μL點(diǎn)將重復(fù)性由0.98%提高到0.53%;在10 μL點(diǎn)將重復(fù)性由1.83%提高到1.30%。4)該方法適合在實(shí)驗(yàn)室有高精度天平和密度計(jì)的情況下,適用于0.1 μL到1mL的所以移液器檢定量程,為有實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室提供了一種全新的、更精準(zhǔn)、更快捷的檢測參考標(biāo)定解決方案。