李京洋，姚毅章，趙國廷

齲病是影響人類口腔健康的最常見疾病之一，是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性破壞性疾病。變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是目前世界公認(rèn)的主要致齲菌，其通過粘附、產(chǎn)酸、耐酸等作用導(dǎo)致牙體硬組織脫礦與再礦化的失衡，從而形成齲齒[1-3]。

姜黃素(curcumin)是一種天然的食用色素，被世界衛(wèi)生組織和美國食品藥品管理局以及多個國家準(zhǔn)許作為食品添加劑使用，是從姜科姜黃屬植物姜黃干燥根莖中提取的有效成分，常見的提取方法包括有機(jī)溶劑結(jié)晶法、活性碳層析法、硅膠柱層析法、活性碳層析法、乙酸沉淀法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法等。由于姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種生理特性作用，其在臨床領(lǐng)域的研究受到越來越廣泛的重視[4-6]。

已有學(xué)者研究姜黃素對口腔致齲菌變異鏈球菌致齲毒力因素的影響，張碧楚等[7]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能在不影響浮游細(xì)菌生長的情況下有效抑制變異鏈球菌生物膜的形成，且其抑制程度隨著濃度的增加而增加；在細(xì)菌生物膜形成的復(fù)雜過程中，第一步首先是細(xì)菌粘附于物體的表面，Song等研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠有效抑制變異鏈球菌的粘附能力，包括牙齒表面、膠原蛋白和纖連蛋白胞外基質(zhì)表面[8]；而本課題主要研究姜黃素對變異鏈球菌另一重要毒力因子和致齲因素——產(chǎn)酸耐酸能力的影響，為臨床防齲研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

變異鏈球菌ATCC25175購買于廣東省微生物菌種保存中心，牛心腦浸液培養(yǎng)基(Brain heart infusion，BHI，Difco，美國)；姜黃素(Sigma，美國)；Trizol總RNA試劑提取盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備及測定細(xì)菌的最低抑菌濃度MIC值 將凍干保存的變異鏈球菌ATCC25175于37 ℃厭氧培養(yǎng)(90%氮?dú)猓?%二氧化碳，5%氫氣)、復(fù)蘇、涂片、染色，顯微鏡下觀察確定變異鏈球菌純細(xì)菌，挑取單個菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中，將菌液稀釋至1×108CFU/mL。配制姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，制備成400 mmol/L的原液，按1∶1 000的比例稀釋姜黃素母液于BHI液體培養(yǎng)基中，采用標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法在96孔板連續(xù)二倍稀釋，姜黃素的最終濃度為25、50、100、200、400 μmol/L，于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h。使用肉眼觀察，孔澄清所對應(yīng)的最低藥物濃度為姜黃素的MIC值。

1.2.2 產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn) 將過夜培養(yǎng)的含不同濃度姜黃素的變異鏈球菌菌液離心，姜黃素的濃度分別為1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC和0(不加姜黃素的對照組)，棄上清液，漂洗，調(diào)整D600 nm為0.5左右，重懸于50 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2溶液中，KOH調(diào)整pH為7.2，加入葡萄糖，使其終濃度為1%，每隔10 min檢測其pH值，連續(xù)檢測60 min[9]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.3 耐酸實(shí)驗(yàn) 將過夜培養(yǎng)的含與上述相同的姜黃素濃度的變異鏈球菌菌液離心，棄上清液，漂洗，調(diào)整D600 nm=0.3左右，重懸于甘氨酸(0.1 mol/L，pH=3.0)溶液中，37 ℃放置60 min后梯度稀釋，涂板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率[10]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.4 總RNA的提取 將過夜培養(yǎng)的含與上述相同的姜黃素濃度的變異鏈球菌菌液4 ℃離心，收集細(xì)菌沉淀，用無菌PBS緩沖液沖洗3次后，加入1 mL Trizol 試劑，反復(fù)吹打混勻，加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。用移液槍將上層轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄去上清液，用1 mL 75%的乙醇(用DEPC水配制)洗滌RNA沉淀，10 000 r/min、4 ℃、離心5 min。棄去乙醇，干燥RNA沉淀，加入DEPC水20 μL，用Nanodrop檢測其濃度，于-80 ℃保存。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄RNA 取各實(shí)驗(yàn)組RNA各1 μg，65 ℃煮5 min后立即冰上冷卻。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，10 μL反應(yīng)體系如下：5×PrimeScript buffer (5倍緩沖液)2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix(逆轉(zhuǎn)錄酶)0.5 μL，Oligo dT Primer(寡核苷酸)0.5 μL，Random 6 mers (6核苷酸隨機(jī)引物)0.5 μL，RNA 1 μg，Nuclease free H2O(不含RNase)的水至10 μL。反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將cDNA稀釋10倍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 實(shí)時定量熒光PCR(Real time PCR)檢測ldh基因表達(dá) 總反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Green Real time PCR 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)0.5 μL× 2，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，羅氏熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、60 s；擴(kuò)增40個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為變性95 ℃、15 s，退火58 ℃、15 s，延伸72 ℃、45 s。引物序列：ldhF 5′-ACTTCACTTGATACTGCTCGTT-3′；ldhR 5′-ACACCAGCTACATTGGCATGA-3′；內(nèi)參基因16SrRNAF 5′-AGCGTTGTCCGGATTTATTG-3′；16SrRNAR 5′-CTACGCATTTCACCGCTACA-3′[11]。每個樣品均設(shè)置3附孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。分析測定目的基因乳酸脫氫酶編碼基因ldh及內(nèi)參16SrRNA的Ct 值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值?；虮磉_(dá)水平用倍數(shù)變化來表示(2-ΔΔCt法)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 最低抑菌濃度MIC的測定結(jié)果

肉眼觀察96孔板中不同濃度姜黃素對變異鏈球菌的影響，結(jié)果表明姜黃素濃度大于100 μmol/L的菌液無明顯生長，其孔澄清，而陽性對照混濁，見圖1，因此，姜黃素對變異鏈球菌的最低抑菌濃度MIC為100 μmol/L。

圖1 姜黃素對變異鏈球菌MIC值

2.2 產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果

姜黃素影響變異鏈球菌產(chǎn)酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，從圖中看出，在最初10 min，pH值明顯降低，此時在1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC濃度下變異鏈球菌的pH值從起始的7.2降低為5.14±0.09，5.2±0.12和5.36±0.13，但均高于對照組的5.01±0.13；之后隨著時間的增長，細(xì)菌的pH值逐漸趨于平穩(wěn)，60 min后，在亞抑菌濃度(1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC)下，變異鏈球菌最終的pH值分別為4.52±0.12，4.58±0.12和4.66±0.02，仍然都高于對照組的4.41±0.13，其中細(xì)菌在1/2 MIC濃度下的pH與對照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明姜黃素對變異鏈球菌產(chǎn)酸有抑制作用，且抑制作用隨著姜黃素濃度的增加而增加。

圖2 姜黃素對變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的作用

2.3 耐酸實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果

姜黃素影響變異鏈球菌耐酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，從圖中看出，加入姜黃素明顯降低變異鏈球菌在酸性環(huán)境中的存活率，且隨著姜黃素濃度的增加，細(xì)菌的存活率隨之降低，當(dāng)姜黃素濃度為1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC時，細(xì)菌的存活率分別為(12.5±0.9)%，(10.8±1.1)%和(5.6±0.4)%，均明顯低于對照組的(23.4±1.6)%。加不同濃度姜黃素實(shí)驗(yàn)組與不加姜黃素的對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明姜黃素對變異鏈球菌耐酸有抑制作用，且抑制作用隨著姜黃素濃度的增加而增加。

*：P<0.05

2.4 ldh基因表達(dá)的定量檢測結(jié)果

姜黃素對變異鏈球菌乳酸脫氫酶LDH編碼基因ldh表達(dá)的影響見圖4，從圖中看出，加入姜黃素使得變異鏈球菌ldh基因的表達(dá)下調(diào)，且隨著姜黃素濃度的增加(1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC)，ldh基因的表達(dá)隨之降低，分別為0.73±0.06，0.56±0.04和0.38±0.01。加不同濃度姜黃素實(shí)驗(yàn)組與不加姜黃素的對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明姜黃素能抑制變異鏈球菌ldh基因表達(dá)，且抑制作用隨著姜黃素濃度的增加而增加。

*：P<0.05

3 討 論

齲病是以細(xì)菌為主，由多種因素如環(huán)境、宿主、時間等共同作用所導(dǎo)致的慢性感染性疾病，其發(fā)病率高，分布廣，是口腔主要的常見病，被世界衛(wèi)生組織WHO列為危害人類健康的三大重點(diǎn)疾病之一。變異鏈球菌在齲病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用，變異鏈球菌是目前公認(rèn)的主要致齲菌，能夠利用日常攝入的碳水化合物代謝產(chǎn)酸致使牙體硬組織脫礦，從而導(dǎo)致齲齒形成[12-13]。變異鏈球菌是產(chǎn)酸耐酸菌，能在外源性糖充足的條件下產(chǎn)生乳酸，當(dāng)牙面微環(huán)境的pH值降低到釉質(zhì)和牙本質(zhì)脫礦的臨界值以下時，會導(dǎo)致齲病的發(fā)生；變異鏈球菌也能在亞致死性酸環(huán)境中生長，并通過引起自身基因表達(dá)的變化提高在致死酸性環(huán)境中的生存能力[14-16]。因此抑制致齲菌變異鏈球菌產(chǎn)酸耐酸是有效防止致齲菌感染的方法，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)使用氟化物防齲的方法存在著一定缺陷，例如慢性氟中毒危害人體健康、口腔中耐氟菌株的產(chǎn)生等等；最近研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物具有資源豐富、分布廣泛、毒副作用小等諸多優(yōu)勢成為最新的研究熱點(diǎn)，為未來的防齲途徑提供了新思路。

本實(shí)驗(yàn)主要研究姜黃素對變異鏈球菌產(chǎn)酸、耐酸及相關(guān)基因ldh表達(dá)的作用，首先確定姜黃素對變異鏈球菌的最低抑菌濃度MIC值，隨后研究發(fā)現(xiàn)其在不影響浮游細(xì)菌生長的前提條件下，能夠有效抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸和耐酸能力，且隨著姜黃素的濃度增加，抑制細(xì)菌的產(chǎn)酸和耐酸能力也隨之增加；乳酸脫氫酶LDH是葡萄糖的厭氧主要代謝途徑Embden-Meyerhof途徑的終結(jié)酶，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，是合成乳酸的關(guān)鍵酶[17-18]，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制乳酸脫氫酶LDH編碼基因ldh的表達(dá)，這一點(diǎn)與Xu等在研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯對變異鏈球菌產(chǎn)酸毒力時發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相同[19]。Hillman通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建ldh基因敲除株，發(fā)現(xiàn)該基因敲除株在動物體內(nèi)的致齲能力明顯低于野生株[20]。因此我們推測姜黃素可能通過有效抑制LDH的活性，從而降低細(xì)菌的產(chǎn)酸能力。我們這些研究結(jié)果表明姜黃素能有效抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸和耐酸能力，為臨床齲病預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。