◆作者：莊姜云 唐媛媛 黃武 伍志強(qiáng) 詹海毅

◆單位：1.湛江市海關(guān)技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室；2.中國(guó)檢驗(yàn)驗(yàn)證集團(tuán)廣東有限公司湛江分公司

孔雀石綠和結(jié)晶紫是一類三苯甲烷類染料，最先應(yīng)用在紡織工藝，因其具有消毒和殺菌作用而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中?？兹甘G是一種極易溶于水，它可用作治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細(xì)菌感染，用作抑菌劑或殺阿米巴原蟲劑（邁新等，2000）,所以有水產(chǎn)品養(yǎng)殖者向飼料中直接添加孔雀石綠，用于預(yù)防與治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病等（邱緒建等，2006；翟毓秀等，2007）。由于孔雀石綠和結(jié)晶紫具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點(diǎn)，當(dāng)其進(jìn)入生物體內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生具有更強(qiáng)危害的隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫。因此，包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物。2019 年12 月27 日，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將孔雀石綠列入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單，同時(shí)禁止用于所有食用動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)節(jié)。

廣東省湛江市是一個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖豐富的沿海城市，這里有不少水產(chǎn)飼料生產(chǎn)企業(yè)，同時(shí)也進(jìn)口大量魚粉、蝦片等飼料以滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖的廣闊市場(chǎng)。由于魚粉是飼料中動(dòng)物蛋白的主要來(lái)源,含有孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的魚粉添加到飼料中, 會(huì)通過(guò)食物鏈威脅人類身體健康。因此，加強(qiáng)對(duì)飼料安全監(jiān)管，建立對(duì)飼料中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留的檢測(cè)方法十分必要。目前研究報(bào)道的水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留檢測(cè)方法較多，而與飼料中同時(shí)檢測(cè)這四種殘留物的相關(guān)研究報(bào)道較少，本文主要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)工作，通過(guò)固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的殘留量（GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》；NY/T 1756-2012 飼料中孔雀石綠的測(cè)定 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法），確定了準(zhǔn)確、快速、低成本的前處理方法，以供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀G6400系列三重四極桿質(zhì)譜，配ESI 離子源；Agilent24 孔的固相萃取儀；離心機(jī)，Anke TDL-5-A,Anke LXJ-ⅡB；氮吹儀；渦旋混勻器；超聲波清洗器，SB5200DDT。

1.2 試劑和材料

乙腈(液相色譜級(jí))；甲酸(液相色譜級(jí))；5 mol·L－1乙酸銨緩沖溶液；中性氧化鋁柱（1000mg/6mL），使用前用5mL乙腈活化柱子；中性氧化鋁，層析用。標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫均購(gòu)買于Dr.Ehrenstorfer 公司,純度99.0%以上。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（500mg/kg），分別稱量10mg（精確到0.1 mg）于不同的25mL 棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度?？兹甘G、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)第一中間液（10mg/kg），分別吸取0.50mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（500mg/kg）于25mL容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫和隱性結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)第二中間液（1mg/kg）：準(zhǔn)確吸取1.0mL 第一標(biāo)準(zhǔn)中間液（10mg/kg） 于10mL 容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。

標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液(20μg/kg)：準(zhǔn)確吸取0.2mL 標(biāo)準(zhǔn)第二中間液（1mg/kg）于10mL 容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度。準(zhǔn)確移取適量上述MG、LMG、CV、LCV 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/kg 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Xdbc18 5μm 柱（4.6×50mm）；流動(dòng)相：溶劑A 為0.1%甲酸水溶液+5mMol/L 乙酸銨水溶液，溶劑B為乙腈，洗脫梯度見(jiàn)表1，進(jìn)樣量5μL；柱溫35℃；流速：7L/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：ESI，正離子檢測(cè)；監(jiān)測(cè)方式：MRM；霧化氣NEB：45；碰撞氣CAD:9；電離電壓：3500V；離子化溫度：500℃。Q1 和Q3 均為單位分辨率。主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

表2 主要質(zhì)譜參數(shù)

1.4 定性標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 保留時(shí)間

根據(jù)試樣中被測(cè)物的含量情況，選取響應(yīng)值相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜分析。標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)液中孔雀石綠、隱性孔雀石綠的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)。參考保留時(shí)間為3.06min(孔雀石綠)、5.39min(隱性孔雀綠)、3.55min (結(jié)晶紫）、5.43min(隱性結(jié)晶紫)。在同一測(cè)定條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)與同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品的定性峰值保留時(shí)間相同，偏差為±2.5%。

1.4.2 信噪比

待測(cè)化合物的每一個(gè)重構(gòu)離子色譜圖的信噪比大于等于3。

1.4.3 定量離子、定性離子及子離子豐度比

各項(xiàng)化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，并且同一檢測(cè)批次對(duì)同一種化合物，兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍應(yīng)為20%以內(nèi)。

1.5 樣品的提取

稱取粉碎后的樣品2.0g（精確至0.001g）于50mL 離心管中，依次加入約0.5g 中性氧化鋁（6.1.3）和5mL 乙腈，振蕩器激烈震蕩15min，超聲提取30 min，4000rpm 離心10min，移取上清液于50mL 具塞比色管中。樣品再加入5 mL 乙腈，該提取液留作第二次提取用，振蕩器激烈震蕩15min，超聲提取30 min，4000rpm 離心10min，移取離心后的上清液合并至50mL 具塞比色管中。

1.6 樣品凈化

用5mL 乙腈活化中性氧化鋁柱，取上清液10mL 過(guò)柱,常壓下流出，再用2mL乙腈沖洗柱子，收集全部流出液，在40℃下用氮?dú)獯蹈?，?.0mL 乙腈- 水（1+1）定容，旋渦震蕩1min，1000rpm 離心10min,溶液過(guò)0.22μm 有機(jī)相濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)4 種化合物進(jìn)行定量分析，制備工作曲線。加化合物制成 0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/kg的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，按設(shè)定的色譜條件進(jìn)行儀器分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，見(jiàn)表3。

由表3 可見(jiàn)，4 種化合物標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)平方的偏差值大于0.995，質(zhì)量濃度為0.5～8.0μg/kg 時(shí)線性良好。

2.2 回收率和精密度

取南美白對(duì)蝦飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。分別進(jìn)行0.5、1.0、4.0μg/kg 添加濃度的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度做6 個(gè)平行，分別計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

從回收率結(jié)果可以看出，南美白對(duì)蝦飼料樣品為0.5～4.0μg/kg添加濃度時(shí)，平均回收率為93.5%～117.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜3.3%，可見(jiàn)本方法能滿足飼料中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物的檢測(cè)。

表3 不同化合物的線性回歸方程與線性范圍

表4 不同濃度中四種化合物的添加回收率和精密度

2.3 前處理方法的優(yōu)化

目前乙腈是提取孔雀石綠的最佳溶劑（竇紅，2010；詹月華等，2009）。但是溶解能力強(qiáng)的乙腈也極易溶解其他雜質(zhì)，從而影響結(jié)果，而且大量使用純乙腈易造成溶解費(fèi)用大、毒性污染大。本方法用了10mL 乙腈溶劑提取，提取量少，減少環(huán)境的污染。

2.4 固相萃取柱的選擇

由于飼料中含有濃重的色素、脂肪、粉塵等細(xì)小顆粒，且大部分易溶于水溶液，所以需要通過(guò)固相萃取柱來(lái)凈化。由于樣品的凈化，用中性氧化鋁柱串接在丙基磺酸陽(yáng)離子樹脂PRS 柱上，成本高，消耗試劑多，對(duì)環(huán)境污染大。所以本實(shí)驗(yàn)只用了中性氧化鋁柱，回收率高和線性良好，降低實(shí)驗(yàn)的成本。

3 結(jié)論

本文研究飼料中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜前處理?xiàng)l件。通過(guò)乙腈的提取量選擇和凈化方式的選擇、方法的回收率以及線性范圍進(jìn)行了探討。由于方法的改進(jìn)更利于降低檢測(cè)成本，使檢測(cè)低限可以達(dá)0.5μg/kg，可操作性強(qiáng)。該方法總體而言，精密度好，靈敏度高，能簡(jiǎn)便、廉價(jià)、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定飼料中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物，對(duì)于飼料中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物的檢測(cè)有一定意義。

參考文獻(xiàn)：（略）