楊 龍 關(guān)二旗 楊玉玲 李萌萌 卞 科

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

小麥赤霉病是一種由多種鐮刀菌引起的世界性流行病害，多發(fā)于氣候溫潤多雨的溫帶地區(qū)，在我國流行區(qū)域主要集中在東北春麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)[1]。小麥揚花期時多為溫暖多雨天氣，為赤霉病病菌侵染提供了有利環(huán)境條件，使我國成為世界上麥類赤霉病發(fā)生頻率最高、受影響最大的國家之一[2]。赤霉病不僅造成小麥產(chǎn)量損失和品質(zhì)的下降，更為重要的是嚴(yán)重影響食品安全，對人畜有較大的危害[3, 4]。因此，設(shè)法降解赤霉病小麥中的真菌毒素，在保障消費者健康、減少經(jīng)濟損失、加快該產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展等方面具有重大的經(jīng)濟意義和社會意義[5]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌侵染谷物后所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是赤霉病小麥中最主要的真菌毒素，DON具有很強毒性，人誤食含有嘔吐毒素的食物后，常會引起四肢無力、頭昏、發(fā)熱、腹脹、腹瀉和嘔吐等癥狀，動物對嘔吐毒素具有一定的敏感性。嚴(yán)重影響人畜健康[6, 7]。隨著赤霉病在世界范圍內(nèi)的蔓延，國內(nèi)外學(xué)者對DON的削減方法進行了大量的研究和探索。目前，關(guān)于DON的削減技術(shù)主要集中在物理法、化學(xué)和生物方法上，其中物理方法主要包括小麥加工(清洗、分選、研磨[8, 9])、熱處理(過熱蒸汽[10]、焙烤[11])、輻照(紫外光[12]、60Co-γ射線[13]和微波誘導(dǎo)[14])和吸附[15]等；化學(xué)方法包括SO2[16]和Na2CO3[17, 18]等；生物法包括利用酶(嘔吐毒素糖基化酶[19]等)、微生物(米曲霉[20]、乳酸菌[21]、放線菌[22]、腸桿菌[23]等)將毒素代謝為無毒產(chǎn)物等。無論物理方法、化學(xué)方法還是微生物方法均存在一定的缺陷，如物理方法脫毒效果差、影響小麥品質(zhì)等；化學(xué)方法可能有化學(xué)物質(zhì)的殘留或產(chǎn)生新的有毒物質(zhì)；生物法工藝難度大、見效周期較長、經(jīng)濟成本過高、可能產(chǎn)生有害物質(zhì)等，因此尋找更為安全有效的DON降解方法迫在眉睫。為解決現(xiàn)有技術(shù)手段存在的問題，目前大量研究紛紛轉(zhuǎn)向兩項或多項技術(shù)的聯(lián)合處理，提高有機物的降解率[24]。

臭氧(O3)因其具有極強的氧化性，而且無毒性殘留，已被普遍認(rèn)為是一種安全、可直接應(yīng)用于食品加工的處理手段[10]。近年來，國內(nèi)外研究者就臭氧氣體[25, 26]或臭氧水[27]對小麥籽粒和全麥粉中DON降解效果進行大量研究，但單獨臭氧處理存在臭氧濃度過高、費用高、礦化程度低和利用率低等缺點，因此有研究者將其與其他技術(shù)聯(lián)合使用，以獲取更好的降解效果和經(jīng)濟效益。超聲波具有特殊的物理化學(xué)效應(yīng)，特別是超聲空化所產(chǎn)生的高溫、高壓，為有機物的化學(xué)反應(yīng)提供了極端的物理化學(xué)環(huán)境[28]。超聲波技術(shù)具有操作和控制容易，在處理中不引入其他的化學(xué)物質(zhì)，且反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊[29]。有研究者將超聲波技術(shù)與臭氧結(jié)合，進行食品保加工[30, 31]、污水處理[32, 33]、農(nóng)殘降解[34]等處理。但是，采用臭氧水協(xié)同超聲波聯(lián)合降解DON的研究卻鮮有報道。因此，本研究采用臭氧水協(xié)同超聲波處理赤霉病小麥，探究不同協(xié)同處理方式對DON降解的規(guī)律，并確定臭氧水協(xié)同超聲波處理赤霉病小麥籽粒降解DON 的最佳工藝條件，為臭氧水協(xié)同超聲波處理在DON降解中的應(yīng)用提供更多理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霉病小麥：河南省南陽市；DON 純品(純度≥99%)、乙腈(色譜級)、乙腈(分析級)、甲醇(色譜級)、甲醇(分析級)、超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SFX 20:0.55超聲波破碎儀，COM-AD-01高濃度臭氧發(fā)生儀，JSA9-O3-UV便攜式紫外臭氧檢測儀，SFX 20:0.55超聲波細胞破碎儀,Waters e2695液相色譜儀,12165001B BEM多功能凈化柱,Centrifuge 5810R高速離心機,MTN-2800D氮吹濃縮儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 臭氧水的制備

打開臭氧發(fā)生器，待設(shè)備穩(wěn)定后，開啟氧氣罐閥門，制備的臭氧通過鼓泡法直接通入常溫的超純水中獲得臭氧水，通過控制通氣時間和氣體流量獲得不同濃度的臭氧水。臭氧水濃度的測定參考郝淑賢等[35]的方法。

1.3.2 不同聯(lián)合處理方式對小麥中DON的降解效果影響

將25 g經(jīng)清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min。在臭氧水濃度為58.32 mg/L、超聲振幅為50%條件下，研究臭氧水和超聲波聯(lián)合處理的方式，分別采用單一、串聯(lián)、先單一后并聯(lián)、先并聯(lián)后單一和并聯(lián)的方式研究對小麥中DON的降解效果，確定最佳處理方式。如表1所示，小麥籽粒具體處理方法如下：T1，未進行任何處理的赤霉病小麥籽粒；T2，單一處理實驗，超聲波(超純水)處理10 min；T3，單一處理實驗，臭氧水浸泡處理10 min；T4，串聯(lián)實驗，先臭氧水后浸泡5 min，后超聲波(超純水)處理5 min；T5，串聯(lián)實驗，先超聲波(超純水)處理5 min，后臭氧水后浸泡5 min；T6，先臭氧水后浸泡5 min，后超聲波(臭氧水)處理5 min；T7，先超聲波(臭氧水)處理5 min，后臭氧水后浸泡5 min；T8，聯(lián)合處理，臭氧水浸泡與超聲波處理同時進行10 min。每個處理進行三組平行實驗。

表1 不同臭氧水和超聲波聯(lián)合處理方式的設(shè)置

1.3.3 臭氧水協(xié)同超聲波處理對小麥中DON的降解效果影響

處理方式確定后，分別研究臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比(超聲波處理時間與臭氧水處理時間的比值)三個因素對小麥中DON降解效果的影響。每個處理設(shè)置三個平行。

1.3.3.1 不同臭氧水濃度小麥中DON的降解效果影響

將25 g經(jīng)清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min，在超聲振幅為50%、處理時間比為5∶5條件下，先加入75 mL超純水后超聲波處理5 min，倒盡水后再加入75 mL臭氧水浸泡5 min，臭氧水濃度分別為14.58、29.16、43.74、58.32 mg/L，對照組未經(jīng)任何處理。處理完后，將小麥籽粒放入40 ℃烘箱中烘干，4 ℃下儲存?zhèn)溆?。烘干后小麥水分含量測定參照GB/T 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》。

1.3.3.2 超聲振幅對小麥中DON的降解效果影響

將25 g經(jīng)清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min，在臭氧水濃度為58.32 mg/L、處理時間比為5∶5條件下，先加入75 mL超純水后超聲波處理5 min，倒盡水后再加入75 mL臭氧水浸泡5 min，超聲振幅分別設(shè)定為10%、30%、50%、70%，對照組未經(jīng)任何處理，其余步驟同上。

1.3.3.3 處理時間比對小麥中DON的降解效果影響

將25 g經(jīng)清理除雜的小麥樣品置于400 mL燒杯中，處理總時間為10 min，在超聲振幅為50%、臭氧水濃度為58.32 mg/L條件下，先加入75 mL超純水后進行超聲波處理，倒盡水后再加入75 mL臭氧水進行浸泡處理，處理時間比分別設(shè)定為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1，對照組未經(jīng)任何處理，其余步驟同上。

1.3.4 正交優(yōu)化降解小麥中DON工藝參數(shù)

在以上單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行正交實驗，選擇L9(34)正交表對臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比3個因素進行優(yōu)化，以確定DON降解的最佳條件，因素與水平表見表2。

表2 正交實驗因素與水平設(shè)計表

1.3.5 DON的測定

DON的提取、凈化參照Liu Yuanxiao等[10]的方法。利用高效液相色譜法對 DON進行定量檢測，檢測方法參考Li Mengmeng等[36]的研究。

DON降解率的計算：

DON降解率=(1-CA/C0)×100%

式中：CA為小麥樣品經(jīng)不同方式處理后DON的濃度/mg/kg；C0為小麥樣品中DON的初始濃度/mg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗指標(biāo)重復(fù)測定三次，測定的數(shù)據(jù)通過Excel 2010處理，并用SPSS 20進行顯著性(P<0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可知，DON標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，DON質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方程表達式為y=1.84×104x-2.69×102，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠?qū)Υ郎y樣品中DON含量進行準(zhǔn)確定量。

圖1 DON溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同臭氧水和超聲波聯(lián)合處理方式對小麥中DON降解效果的影響

在相同的臭氧水濃度和超聲振幅下(58.32mg/L，50%)，研究不同的處理方式對小麥中DON降解效果，分別采用了單一、串聯(lián)、并聯(lián)以及混合聯(lián)合的方式處理小麥，總處理時間為10 min，結(jié)果見表3。

表3 不同臭氧水和超聲波聯(lián)合處理方式對小麥中DON降解效果的影響

比較表3中的處理方式可知，當(dāng)采用T6(先臭氧水處理5 min再聯(lián)合處理5 min)DON降解效果最差，降解率顯著低于其他處理方式(P<0.05)；并聯(lián)方式T8(超聲波和臭氧水協(xié)同處理10 min)DON降解率與單一方式T3(臭氧水處理10 min)無顯著性差異(P>0.05)。這可能是因為超聲波促進臭氧分解產(chǎn)生更多·OH自由基，同時也會加快臭氧水中臭氧分子的溢出，導(dǎo)致對DON的降解效果并不明顯[34]。同樣是串聯(lián)處理方式，T4(先臭氧水處理5 min后再超聲波處理5 min)的DON降解率顯著降低T5處理(P<0.05)，這可能是因為先超聲波處理時，超聲波的空化作用破環(huán)細胞組織，產(chǎn)生局部破碎，加快分子擴散，有利于DON的溶出，為后續(xù)臭氧水處理時，臭氧分子和·OH自由基更易接觸到DON[28, 31]。當(dāng)采用T7(先超聲波和臭水同時處理5 min，后臭氧水處理5 min)DON降解效果最好，DON含量由2.075 mg/kg降至1.070 mg/kg，降解率為48.43%，這可能與超聲作用加速臭氧溶解，使之產(chǎn)生的自由基與DON更好的接觸并將其氧化分解有關(guān)[28]。與此同時，以T5(先超聲波處理5 min后再臭氧水處理5 min)串聯(lián)方式處理小麥時，DON降解率為46.99%，降解效果與T7處理效果無顯著差異(P>0.05)，因此選擇T5處理進行下一步的單因素實驗。

2.3 不同臭氧水濃度對小麥中DON降解效果的影響

前期對不同單一和聯(lián)合處理方式對DON的降解效果進行比較分析，確定T5(先超聲波處理5 min，再臭氧水處理5 min)為最佳聯(lián)合處理方式，在此基礎(chǔ)上，改變臭氧水濃度(超聲波振幅為50%，處理時間共10 min)，對小麥中DON降解效果進行研究，結(jié)果如表4所示。研究表明，不同濃度臭氧水處理小麥籽粒5 min后，其DON有明顯的降解效果。隨著臭氧水濃度的增大，小麥中DON含量顯著降低(P<0.05)。當(dāng)臭氧水濃度為58.32 mg/L時，DON含量降至1.228mg/kg，降解率高達到41.55%。提高臭氧水質(zhì)量濃度，DON 與臭氧分子接觸機會越大，生成的·OH自由基也越多，間接氧化作用越顯著，因而降解作用越強[37]。

表4 不同臭氧水濃度對小麥中DON降解效果的影響

2.4 超聲振幅對小麥中DON降解效果的影響

在確定T5(先超聲波處理5 min后再臭氧水處理5 min)為最佳聯(lián)合處理方式的基礎(chǔ)上，改變超聲振幅(臭氧水濃度為58.32 mg/L，處理時間共10 min)，對小麥中DON降解效果進行研究。結(jié)果表明，超聲波振幅不同，小麥中DON有明顯不同的降解效果(表5)。隨著超聲波振幅的增大，DON含量逐漸降低，降解率逐漸升高。當(dāng)超聲波振幅為70%時，DON含量降至1.145 mg/kg，降解率達到45.47%。這可能是因為超聲波振幅與空化泡崩潰產(chǎn)生的溫度和壓力有關(guān)，振幅增大，導(dǎo)致空化泡更為劇烈地崩潰，從而產(chǎn)生更高的溫度和壓力，同時也增大了羥基等自由基的濃度，使DON削減率提高[38]。

表5 超聲振幅對小麥中DON降解效果的影響

2.5 處理時間比對小麥中DON降解效果的影響

在確定T5(先超聲波處理5 min后再臭氧水處理5 min)為最佳聯(lián)合處理方式的基礎(chǔ)上，改變超聲波和臭氧水的處理時間比(超聲波振幅為50%、臭氧水濃度為58.32 mg/L)，對小麥中DON降解效果進行研究。由表6可知，隨著超聲波處理時間的延長和臭氧水處理時間的縮短，DON含量整體呈降低趨勢，降解率整體呈升高趨勢。當(dāng)先超聲波處理9 min再臭氧水處理1 min時，小麥中DON含量降至1.198 mg/kg，降解率達到45.07%。這是因為隨著超聲波處理時間延長，空化泡數(shù)量逐漸增多，空化泡崩潰產(chǎn)生的高溫高壓和強氧化性自由基有利于DON的降解；此外，超聲波處理時間延長，會促使溶液溫度升高，導(dǎo)致水的蒸汽壓升高，表面張力和粘滯系數(shù)降低，從而更有利于空化泡的產(chǎn)生，提高DON的削減率[39]。

表6 處理時間比對小麥中DON降解效果的影響

2.6 正交實驗結(jié)果與分析

對臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比進行正交實驗，以確定DON降解的最佳條件(表7)。研究表明，對小麥中DON降解率影響因素次序為C>A>B，即對小麥中DON降解率影響最大的因素是處理時間比，其次是臭氧水濃度和超聲振幅。因此，通過正交實驗優(yōu)化臭氧水協(xié)同超聲波降解小麥中DON工藝條件，最優(yōu)工藝條件為A3B2C3，即臭氧水濃度為58.32 mg/L，超聲振幅為60%，處理時間比為9∶1，此條件下DON降解率最高，為50.84%。

表7 正交實驗結(jié)果

3 結(jié)論

超聲波和臭氧水不同聯(lián)合處理方式對赤霉病小麥中DON有不同的降解效果。本實驗分別采用單一、串聯(lián)、先單一后并聯(lián)、先并聯(lián)后單一和并聯(lián)的方式來研究臭氧水協(xié)同超聲波聯(lián)合處理方式對小麥中DON的降解效果。綜合考慮，確定了最佳處理方式為串聯(lián)T5，即先超聲波處理5 min再臭氧水處理5 min，此時赤霉病小麥中DON降解率最高，為46.99%。T5處理方式比之單一超聲波和單一臭氧水處理對赤霉病小麥中DON降解效果更佳，降解率分別提升約46.07%和28.84%。

在T5串聯(lián)處理方式下探討臭氧水濃度、超聲振幅和處理時間比對DON降解效果的影響。研究表明，臭氧水濃度、超聲振幅增大，超聲波處理時間的延長，均會導(dǎo)致DON降解率的顯著升高，三者對小麥中DON降解率影響因素次序為：處理時間比>臭氧水濃度>超聲振幅，DON降解最優(yōu)工藝條件為：臭氧水濃度為58.32 mg/L，超聲振幅為60%，處理時間比為9∶1，DON降解率最高為50.84%。