李顯剛　姚拓　舒鍵虹　高巍

摘要：百脈根根際分離出根瘤菌2株（LC15、LC20）與白三葉根際中分離出根瘤菌RW183基因組DNA經(jīng)PCR擴增16S rDNA序列、陽性克隆檢測、質(zhì)粒提取測序，并與GenBank中已知序列比對，結果表明，菌株LC15與LC20的16S rDNA序列與多株克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超過99.00%，RW18與勒克氏菌屬中的Leclercia adecarboxylata（HQ242722）核苷酸序列同源性為99.79%，結合各菌株的主要生理生化特征，將菌株LC15與LC20初步鑒定為Klebsiella sp.，將菌株RW18鑒定為Leclercia sp.。

關鍵詞：促生菌;16S rDNA序列;豆科牧草;百脈根;白三葉

中圖分類號：S541;Q785? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）06-0005-03

隨著農(nóng)牧業(yè)和園林綠化（包括草坪業(yè)）的發(fā)展，以新型肥源替代部分化肥的應用成為生態(tài)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢，百脈根和白三葉得到更多、更廣的應用。本研究從生長在貴州黔南地區(qū)的百脈根根際分離出根瘤菌2株（LC15與LC20），白三葉根際中分離出根瘤菌1株（RW18），均具有溶解多種難溶磷源及分泌植物生長激素（IAA）的功能，并對其部分生物學特征了進行了初步研究，采用16S rDNA分子生物學技術，對3菌株的基因序列、系統(tǒng)發(fā)育學和分類地位進行分析，旨在為進一步提高喀斯特地區(qū)土壤中磷素的循環(huán)利用提供基礎，為開發(fā)利用百脈根及白三葉根際溶磷微生物資源及其綠色無公害生產(chǎn)提供促生菌菌種資源。

1? 菌株菌落特征觀察及主要生理生化特征測定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[1]對菌株菌落形態(tài)特征（菌落質(zhì)地、形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀，透明度、生長速度等）、主要生理生化特征[葡萄糖利用、甘露醇利用、麥芽糖利用、果糖利用、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽試驗、過氧化氫酶試驗、吲哚試驗、二乙酰（V-P）試驗、硫化氫試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、甲基紅（M-R）試驗等]進行試驗和觀察記錄。具體方法見文獻[2]。

1.1? 細菌總DNA提取

將供試菌株用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)活化并檢查純度后，采用寶生物（大連）公司提供的細菌DNA基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA。

1.2? 16S rDNA的PCR擴增

將提取的菌株基因組DNA稀釋至20 ng/μL，并以此濃度的細菌總DNA為模板，擴增16S rDNA。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

正向引物：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。

PCR擴增體系為25 μL，以滅菌的ddH20代替模板DNA作為陰性對照，反應體系組成如下：10×buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物（10 μmol/L）1.0 μL，模板1.0 μL（20 ng/μL），Taq DNA Polymeras 0.25 μL，ddH20 17.25 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，循環(huán)30次，25 ℃ 2 min。然后將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3? PCR擴增產(chǎn)物的回收與檢測

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后，利用OMEGA BIO-TEK公司提供的Get Extraction Kit（50）D-2500-01試劑盒進行產(chǎn)物回收，回收產(chǎn)物再次經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4? PCR產(chǎn)物的回收連接轉(zhuǎn)化

取1.0 μL PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD 18-T Vector連接，5 μL連接反應體系中含有pMD 18-T Vector 0.5 μL、Ligation solution 2.5 μL、PCR擴增產(chǎn)物1.0 μL、無菌ddH20 1.0 μL。充分混勻后離心數(shù)秒，將管壁液滴收到管底，16 ℃水浴16～18 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5ɑ感受態(tài)細胞，涂平板，待菌液吸干后，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～16 h，隨機挑取白色單菌落至含有Amp 50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200～300 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后以1 μL菌液為模板進行PCR擴增反應，反應條件同“1.2”，并取1 mL培養(yǎng)物用于質(zhì)粒抽提，然后進行PCR鑒定。

1.5? 16S rDNA序列測定、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株質(zhì)粒產(chǎn)物送交上海生工進行測序。測序結果用DNAMAN軟件進行序列拼接，測序結果提交GenBank中的Blast數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，經(jīng)Clustal（1.8）軟件進行多重序列比較后，結合菌株的生理生化特征，用Mega2.0軟件中的鄰位相連法（Neighbor-jioning）構建菌株系統(tǒng)進化樹。

2? 結果與分析

2.1? 菌株的菌落及生理生化特征

試驗對LC15、LC20、RW183菌株進行了生理生化特征初步鑒定。3株菌在LB固體培養(yǎng)基上生長3 d后菌落特征為：菌株LC15菌落大、不規(guī)則，菌落顏色為淡白色，不透明，濕潤，菌落中間凸起，邊緣光滑;菌株LC20菌落大，不規(guī)則，菌落顏色為乳白色，邊緣不整齊、光滑，半透明，濕潤，菌落中間凸起;菌株RW18菌落小，不規(guī)則，菌落邊緣淡白色，中間淡黃色、凸起，菌落濕潤、不透明。

3株菌的主要生理生化特征見表1。由表1可知，菌株LC15及LC20的吲哚試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗及明膠液化試驗結果呈陰性，淀粉水解、檸檬酸鹽利用、過氧化氫酶產(chǎn)氣、二乙酰（V-P）與硫化氫變色及硝酸鹽還原試驗結果呈陽性;菌株RW18不利用檸檬酸鈉、吲哚及苯丙氨酸脫氨酶，試驗不變色，且不能使明膠發(fā)生液化，但能使淀粉水解、過氧化氫酶產(chǎn)氣、硝酸鹽還原，二乙酰（V-P）及硫化氫試驗呈陽性。

2.2? PCR產(chǎn)物電泳及其產(chǎn)物回收

對各菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌體進行收集，并提取總DNA，將各菌株基因組DNA稀釋到20 ng/μL，并以此為模板進行PCR擴增，其擴增產(chǎn)物電泳見圖1。各菌株DNA PCR擴增條帶明亮，無雜帶，片段長度約為1 500 bp，與16S rDNA序列分析方法片段大小一致。將各菌株DNA PCR擴增產(chǎn)物進行回收，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1，回收產(chǎn)物無雜帶，明亮。

2.3? DNA PCR擴增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取

將菌株DNA的PCR擴增回收產(chǎn)物進行陽性克隆，在每個菌株的藍白斑平板上隨機挑取5個白色菌落進行液體培養(yǎng)過夜，以菌液為模板進行PCR擴增，檢測是否成功克隆轉(zhuǎn)化子。各菌株轉(zhuǎn)化子菌落電泳見圖2。由圖2可知，各菌株轉(zhuǎn)化子均擴增得到約1 500 bp的條帶，均為陽性克隆。對陽性克隆進行重組質(zhì)粒DNA提取，以重組質(zhì)粒DNA為模板進行PCR擴增，其電泳見圖2。由圖2可知，在約1 500 bp處擴增出特異性明亮條帶，初步說明各菌株的16S rDNA序列已成功插入pMD18載體上。

2.4? 菌株序列分析

將各菌株的重組質(zhì)粒DNA送交上海生物工程公司進行測序，測序結果表明，菌株LC15的目的基因長度為1 441 bp，菌株LC20的目的基因長度為1 429 bp，菌株RW18為1 430 bp。3菌株的目的基因長度接近16S rDNA基因片段的長度，符合試驗目的。采用BLAST程序?qū)?菌株的16S rDNA序列與GanBank中已登錄細菌的16S rDNA序列進行同源性比較，結果發(fā)現(xiàn)，菌株LC15與LC20的16S rDNA序列于多株克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超過99.00%，其中菌株LC15、LC20分別與Klebsiella pneumoniae strain 26（HQ259959）、Klebsiella variicola strain7（HQ259961）的同源性高達99.51%和99.93%;菌株RW18與勒克氏菌屬中Leclercia adecarboxylata（HQ242722）的核苷酸序列同源性為99.79%。菌株LC15與LC20的相似性達到99.37%。

依據(jù)上述比對結果及各菌株的主要生理生化特征，將菌株LC15與LC20初步歸屬為克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）細菌;將菌株RW18歸屬為勒克氏菌屬（Leclercia sp.）。菌株LC15、LC20與RW18的16S rDNA序列同源性系統(tǒng)進化樹見圖3。

3? 討論

促生菌接種于農(nóng)牧作物具有重要作用，例如韓文星[3]、葉喜文等[4，5]、Hariprased等[6]及朱培淼等[7]以溶磷菌為主的PGPR促生菌接種到各試驗材料后的結果表明，作物鮮重、干重、株高、根長、葉綠素含量、穗長、有效分蘗數(shù)以及吸收磷量和根際土壤有效磷含量均較對照或單施N、P、K有不同程度的增加;沈德龍等[8]從水稻中分離的成團腸桿菌YA19可分泌4種生長激素，其中的分裂素包括玉米素核苷、二氫玉米素核苷及異戊烯腺嘌呤;由芽孢桿菌組成的復合解磷菌劑廣泛用于水稻、豌豆等多種農(nóng)作物及牧草上，對發(fā)揮解磷功能和提高農(nóng)牧作物產(chǎn)量具有很好的效果[9];王煒等[10]研究復合菌肥對油菜生長的影響結果表明，其鮮重、葉綠素a及葉綠素b均隨復合菌肥用量的增加而升高;牛廷香等[11]將溶磷菌嫁接到柑桔幼苗后，對改善植株磷素營養(yǎng)和促進苗木生長均有明顯作用。此外，胡曉峰等[12]分離到的一株溶磷細菌，對辣椒疫霉、大麗輪枝菌、煙草疫霉煙草變種和立枯絲核菌有拮抗作用。因此，鑒定本研究中的3株優(yōu)良菌株意義重大，為后期研究3株菌株對農(nóng)牧作物的相關作用奠定基礎。

隨著現(xiàn)代科學技術的不斷發(fā)展，人類對微觀世界的認識也在不斷深入。特別是現(xiàn)代分子生物學的迅速發(fā)展，使得細菌的分類與鑒定更為科學。目前，對細菌的鑒定方法較多，如16S rDNA序列分析、PCR技術、質(zhì)粒圖譜分析法、化學分類鑒定法及核酸雜交技術等。本研究采用16S rDNA序列分析法對3株溶磷菌進行了初步鑒定，并初步確定了菌株LC15與LC20為克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）細菌，菌株RW18為勒克氏菌屬（Leclercia sp.）細菌，由于未對這3株菌的微觀形態(tài)和革蘭氏染色等進行觀察，所用鑒定方法單一，未鑒定到種。

參考文獻：

[1] 中國科學院微生物研究所.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].第九版.北京：科學出版社，1994.

[2] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

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[4] 葉喜文，焦? 峰，吳金花，等.PGPR促生菌肥在水稻上應用效果研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2005，17（1）：9-11.

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[10] 王? 煒，咸拴獅.復合菌肥對鋅污染土壤中油菜生長的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2008，36（1）：73-75.

[11] 牛廷香，鄧? 烈，易時來，等.溶磷菌對柑桔嫁接苗磷素營養(yǎng)及生長發(fā)育的影響[J].中國南方果樹.2011，40（3）：11-14.

[12] 胡曉峰，郭晉云，張? 楠.一株溶磷抑病細菌的篩選及其溶磷特性[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（11）：2253-2260.

收稿日期：2020-04-10

基金項目：國家自然科學基金項目（30960265）;貴州省農(nóng)業(yè)攻關項目[黔科合NY（2009）3067]

作者簡介：李顯剛（1983-），男，貴州遵義人，畜牧師，碩士，主要從事草原監(jiān)測監(jiān)管及草地微生物資源與生態(tài)研究方面的工作，（電話）13595404735

（電子信箱）578912809@qq.com;通信作者，姚? 拓（1968-），男，甘肅靖遠人，教授，博士，主要從事草業(yè)科學（草地微生物和草地保護）

教學及研究工作，（電話）15002623079。