楊妮，劉素純,2*，王繼剛，李幸，劉梟雄

1(湖南農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖南 長沙，410128)2(食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙，410128)

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是廣泛存在于茯磚茶中并使其產生特征風味的優(yōu)勢菌種[1]，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊屬的一種真菌[2]，因其在生長繁殖過程中會產生金黃色的閉囊殼,故俗稱“金花菌”。因冠突散囊菌具有降脂、抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等生理活性[3-6]，使得人們越來越青睞對冠突散囊菌的研究。冠突散囊菌生長時通常會代謝產生大量的色素物質[7]，初期主要色素為黃色素，隨著培養(yǎng)時間的增長會伴隨著黑色素的產生，但其研究鮮見報道。黑色素廣泛存在于動植物和微生物中，是所有已知生物色素中存在最多、最廣的一類色素[8]，研究表明，黑色素具有獨特的生理功能[9]，如避免光對生物體的傷害[10]、強抗氧化性[11-13]、抗癌[14-15]、抗輻射[16]、免疫調節(jié)[17-19]等作用，因此黑色素具有廣闊的應用前景。

本試驗擬采用響應面試驗設計的方法對冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件進行優(yōu)化，探討各因素之間交互作用對黑色素含量的影響，并對其穩(wěn)定性進行研究，旨在為微生物源天然功能性色素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，由湖南安化白沙溪茶廠的茯磚茶中分離獲得。

冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸餾水1 L。

培養(yǎng)條件：裝液量120 mL，轉速140～220 r/min，培養(yǎng)溫度24～32 ℃，培養(yǎng)時間10 d。

NaOH、Na2SO3、H2O2和濃HCl(化學純),由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

ZQPL-200全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；XMTD 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學儀器廠；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機，日本株式會社日立高新技術科學有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；UH5300型分光光度計，日本株式會社日立高新技術科學有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵液的制備及黑色素的提取

黑色素發(fā)酵液的制備：取活化后的冠突散囊菌菌種接種于裝有120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置28 ℃搖床中，180 r/min，培養(yǎng)10 d，過濾得冠突散囊菌發(fā)酵液。

黑色素的提取：據(jù)前期試驗得出的最優(yōu)提取工藝進行提取，準確量取冠突散囊菌發(fā)酵液50 mL，加入70 mL 1 mol/L 的NaOH溶液，在74 ℃水浴中攪拌提取，趁熱過濾，再酸沉(用6 mol/L HCl調濾液至pH值為2.5 后置于74 ℃水浴中靜置4 h，使冠突散囊菌胞外黑色素絮凝使其沉淀)，然后離心去除上清液得到黑色沉淀物，用蒸餾水洗至中性，冷凍干燥后得到黑色素粗品，依次采用乙酸乙酯、氯仿和乙醇分別對黑色素粗品進行萃取提純，冷凍干燥后得到冠突散囊菌胞外黑色素。

1.3.2 色素吸收光譜的測定

取一定量上述黑色素溶于1 mol/L 的NaOH溶液中，并以1 mol/L的NaOH溶液作參比液，用紫外-可見分光光度計于200～800 nm進行光譜掃描[20]，測定黑色素的最大吸收峰值λmax。再用1 mol/L 的NaOH溶液將黑色素溶液稀釋10、20、30、40、50倍，用分光光度計在λmax處測定各稀釋液的吸光度。記錄各稀釋倍數(shù)的吸光度數(shù)據(jù)計算其線性相關性。

1.3.3 冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

將冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基(自然pH)，接種冠突散囊菌后分別置于24、26、28、30、32 ℃搖床中轉速為180 r/min培養(yǎng)10 d，取發(fā)酵液與等體積的1 mol/L 的NaOH于74 ℃水浴中攪拌提取，反應結束后5 000 r/min離心10 min，取上清液測定其在λmax處吸光值，吸光值越高表示黑色素含量越高。每個處理組3個重復。

1.3.3.2 培養(yǎng)基pH對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

將冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH 調節(jié)培養(yǎng)基pH值為5、6、7、8、9，接種冠突散囊菌后于28 ℃搖床中轉速為180 r/min培養(yǎng)10 d，取發(fā)酵液與等體積的1 mol/L 的NaOH于74 ℃水浴中攪拌提取，反應結束后5 000 r/min離心10 min，取上清液測定其在λmax處吸光值，吸光值越高表示黑色素含量越高。每個處理組3個重復。

1.3.3.3 搖床轉速對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

將冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基接種冠突散囊菌后于28 ℃搖床中分別以轉速140、160、180、200、220 r/min培養(yǎng)10 d，取發(fā)酵液與等體積的1 mol/L 的NaOH于74 ℃水浴中攪拌提取，反應結束后5 000 r/min離心10 min，取上清液測定其在λmax處吸光值，吸光值越高表示黑色素含量越高。每個處理組3個重復。

1.3.4 響應面法對冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件的優(yōu)化

以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、搖床轉速作自變量，冠突散囊菌黑色素吸光值為因變量進行響應面試驗，確定冠突散囊菌黑色素的最佳發(fā)酵條件參數(shù)。試驗因素水平編碼見表1。

1.3.5 冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的研究

1.3.5.1 光照對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

取黑色素溶液分為3份，2份分別于自然光、黑暗環(huán)境中放置3 d，每隔1 d取樣測定其在λmax處吸光值，另一份置于紫外燈下，每30 min取樣測定其在λmax處吸光值，觀察光照對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5.2 溫度對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

取黑色素溶液分為4份，1份置于室溫(25 ℃)中避光保存，其余3份分別置于50、70、100 ℃水浴鍋中避光保溫，每30 min取樣，待溶液降溫至室溫后測定其在λmax處吸光值，觀察溫度對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5.3 氧化劑、還原劑對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

以H2O2為氧化劑、Na2SO3為還原劑，配置質量分數(shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的H2O2溶液，0.1%、0.3%、0.5%、1%、1.5%的Na2SO3溶液，分別量取2 mL加入到8 mL黑色素溶液，于室溫中避光放置1 h后測定其在λmax處吸光值。

1.3.5.4 金屬離子對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

配置0.05 mol/L的MgCl2、NaCl、ZnCl2、CaCl2、FeCl3、CuCl2溶液，分別量取2 mL加入到8 mL黑色素溶液，于室溫中避光放置1 h測定其在λmax處吸光值，觀察金屬離子對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.5、Design-Expert 10.0.3和SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 色素吸收光譜的確定

圖1為冠突散囊菌胞外黑色素紫外-可見光譜圖，該種黑色素在紫外可見光區(qū)域里，吸收值隨著波長的增大而降低，且在298 nm處有最大吸收峰,這一特征與吳世玉等[21]，CHENG等[22]和SELVAKUMAR等[23]的結果十分相似。色素溶液線性關系表明不同濃度的色素溶液在298 nm 處與吸光值具有良好的線性關系，其回歸方程為y=-0.015 9x+1.924，R2=0.991 3，說明采用吸光度來研究色素穩(wěn)定性是合理可行的。

圖1 冠突散囊菌胞外黑色素的紫外-可見吸收光譜圖

2.2 冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

不同培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量影響結果如圖2所示。由圖2可知，冠突散囊菌胞外黑色素的吸光值隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當溫度為28 ℃時，吸光值達到最大1.107。根據(jù)郭勁霞等[24]的研究發(fā)現(xiàn),溫度對冠突散囊菌的生長有雙重效應。當溫度高于28 ℃時，冠突散囊菌生長受到抑制，過高溫度在一定程度上也會影響微生物代謝的酶系[25]，從而影響黑色素的生成。

圖2 培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

2.2.2 培養(yǎng)基pH對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

不同培養(yǎng)基pH對冠突散囊菌胞外黑色素含量影響結果如圖3所示。由圖3可知，冠突散囊菌胞外黑色素的吸光值隨著pH的升高呈先上升后下降的趨勢，當pH為7時，吸光值達到最大1.1。在微生物的生長和代謝過程中，培養(yǎng)基pH起著重要的作用，陳云蘭[26]研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌在偏酸性的條件下生長較好，偏堿性的環(huán)境會導致菌株生長緩慢，影響黑色素的生成。

圖3 pH對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

2.2.3 搖床轉速對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

搖床轉速對冠突散囊菌胞外黑色素含量影響結果如圖4所示。由圖4可知，冠突散囊菌胞外黑色素的吸光值隨著搖床轉速的增大呈先上升后下降的趨勢，當搖床轉速為180 r/min時，吸光值達到最大1.067。適宜的搖床轉速能提高溶氧量，有利于冠突散囊菌的生長及黑色素的生成[27]，過高的轉速可導致真菌菌絲體破碎自溶[28]，不利于黑色素的生成。

圖4 轉速對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

2.3 響應面試驗

根據(jù)Box-Benhnken采樣原理，選擇轉速、溫度、pH進行3因素3水平的響應面分析試驗。響應面試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果

利用Design-Expert 10.0.3軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，得到二次多項回歸方程：吸光值=1.267 6+0.085 25×A+0.105 875×B+0.011 375×C+0.069 25×AB+0.027 25×AC+0.002 5×B-0.162 8×A2-0.129 55×B2-0.120 55×C2

表3 響應面擬合回歸方程的方差分析結果

響應面和等高線圖如圖5所示，等高線圖呈現(xiàn)橢圓狀，交互作用顯著，等高線圖呈現(xiàn)圓狀，交互作用不顯著。根據(jù)Design-Expert 10.0.3 軟件運行結果，最優(yōu)發(fā)酵條件組合為轉速 184.096 r/min、溫度 29.145 ℃、pH 6.771，在此條件下模型預測的理論吸光值為1.294。

a-溫度、轉速對吸光值影響的響應曲面；b-溫度、轉速對吸光值影響的等高線；c-pH、轉速對吸光值影響的響應曲面；d-pH、轉速對吸光值影響的等高線；e-pH、溫度對吸光值影響的響應曲面；f-pH、溫度對吸光值影響的等高線

考慮到操作的可行性，將最優(yōu)發(fā)酵條件修改為轉速 184 r/min、溫度 29 ℃、pH 6.8并進行驗證性試驗，在該條件下黑色素吸光值為1.273，在該發(fā)酵條件下提取獲得冠突散囊菌胞外黑色素4.27 g/L。

2.4 冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的研究

2.4.1 光照對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表4可知，自然光對該色素穩(wěn)定性有一定影響，冠突散囊菌胞外黑色素在自然光照條件下，隨著時間的延長，色素逐漸降解，吸光度降低，放置3 d后，色素損失率為14.12%；避光保存對該色素穩(wěn)定性較好，冠突散囊菌胞外黑色素在黑暗條件下保存3 d，其損失率僅為4.33%；紫外光對該色素穩(wěn)定性有較大的影響，冠突散囊菌胞外黑色素在紫外燈下，隨著時間的延長，溶液吸光度降低，3 h后色素損失率達到19.69%。試驗表明，光照會對冠突散囊菌產生不利影響，該種色素應避光保存，且不具備良好的抗紫外輻射能力。

表4 不同光處理對黑色素穩(wěn)定性的影響

2.4.2 溫度對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表5可知，于室溫中保存的該色素穩(wěn)定性較好，其溶液吸光值并無明顯變化；隨著溫度上升，該色素穩(wěn)定性下降，冠突散囊菌胞外黑色素處于100 ℃時，隨著時間的增長，吸光值降低，90 min時其損失率為24.64%，但在70 ℃和50 ℃環(huán)境下，其損失率均低于10%，說明冠突散囊菌胞外黑色素具有一定的耐熱性，該色素在應盡量在低于70 ℃時使用，避免高溫受熱。

表5 溫度對黑色素穩(wěn)定性的影響

2.4.3 氧化劑、還原劑對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表6可知，隨著H2O2溶液質量分數(shù)的增加，黑色素吸光值呈下降趨勢，當質量分數(shù)為2.5%時，其損失率達39.42%，說明該種黑色素容易被H2O2氧化褪色，在使用過程中應盡量避免與強氧化劑接觸。當加入低質量分數(shù)的Na2SO3時，黑色素吸光值呈下降趨勢，當Na2SO3質量分數(shù)為0.3%時，其損失率為11.26%，說明黑色素發(fā)生了一定程度的降解，但Na2SO3質量分數(shù)繼續(xù)增大時，黑色素溶液吸光值變化不大，說明該種黑色素有一定的耐還原性。

表6 氧化劑、還原劑對黑色素穩(wěn)定性的影響

2.4.4 金屬離子對冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表7可知， 該種黑色素對0.05 mol/L的金屬離子有著較好的穩(wěn)定性，但不同金屬離子的影響程度不同，Na+對溶液無明顯影響，Mg2+、Zn2+、Fe3+具有增效作用，其中Fe3+作用效果最好，Ca2+、Cu2+具有降效作用，使用過程中應盡量減少與這含2種離子的化合物接觸。

表7 金屬離子對黑色素穩(wěn)定性的影響

3 結論

本試驗在單因素的基礎上，利用響應面法對冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并建立了可靠的二次多項模型。通過方差分析表明，模型的擬合度較好，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為轉速 184 r/min、溫度 29 ℃、pH 6.8，在該發(fā)酵條件下提取獲得冠突散囊菌胞外黑色素4.27 g/L。所得黑色素在70 ℃以下耐熱性強， Mg2+、Zn2+、Fe3+對其的穩(wěn)定性有增強作用，該黑色素應避光保存，在使用過程中應避免與強氧化劑和還原劑接觸。