鐘彩梅, 鄭秀芬， 黃桃源， 潘惠娟, 鄧裕華， 何仁亮

(1.佛山市順德區(qū)慢性病防治中心皮膚科, 廣東 佛山 528399; 2.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院皮膚科，廣東 佛山 528308； 3.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚外科與皮膚腫瘤科，廣東 廣州 510091； 4.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 510515)

人體皮膚表面存在大量微生物，如細(xì)菌和真菌[1]。細(xì)菌群落主要以痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)為主，而真菌群落主要以球形馬拉色菌(Malasseziaglobosa)為主[1]。目前，脂溢性皮炎(seborrheic dermatitis, SD)皮損處是否存在菌群失調(diào)尚不清楚，且M.globosa一直以來被認(rèn)為是引發(fā)SD的主要致病菌[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用抗真菌藥物治療SD患者后，皮損處球形馬拉色菌的含量先減少，停藥后逐漸升高[4]。因此，SD與微生物之間的相互關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人體的皮膚[5]、腸道[6]、呼吸道[7]、陰道[8]等組織器官被發(fā)現(xiàn)存在有大量的微生物,這些微生物與人體的健康和疾病息息相關(guān)[9-12]。為了探索SD患者與健康人群之間的微生物差異，本研究通過宏基因組測序?qū)D皮損處皮膚微生物樣品進(jìn)行了分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2017年4月—2018年8月本院皮膚科門診的SD患者及健康志愿者。SD組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合SD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]；②治療前3～4周內(nèi)未使用過抗生素、維甲酸類、性激素、皮質(zhì)類固醇激素等藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期及哺乳期患者；②患有高血脂、肝腎功能異常、痤瘡、玫瑰痤瘡、接觸性皮炎等疾病者；③面部使用護(hù)膚品者。健康組納入標(biāo)準(zhǔn)：①面部無炎癥性表現(xiàn)(即紅、腫、熱、痛等)；②無吸煙史;③近1月內(nèi)面部未使用過抗生素、維甲酸類、激素等藥物；④非妊娠期及哺乳期者；⑤無高血脂、肝腎功能異常等系統(tǒng)性疾病。受試者均簽署知情同意書,研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

共納入SD患者17例，其中男7例，女10例；年齡26～40歲，平均29.9歲；主要表現(xiàn)為反復(fù)面部毛孔粗大，皮膚油膩，紅斑，脫屑3個月～1年，部分患者出現(xiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張。健康組共20例，其中男10例，女10例，年齡28～35歲，平均32歲。兩組年齡(t=1.51,P=0.139)及性別(2=0.23,P=0.592)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試劑及儀器

蛋白酶K(美國Thermo Fisher Scientific)、DNA提取試劑盒(MasterPure DNA and RNA Purification Kit, 英國Epicentre)、HiSeq PE Cluster V4試劑盒(美國Illumina)、HiSeq SBS V4 250 cycle試劑盒(美國Illumina)、KAPA LTP文庫純化試劑盒(美國Kapa Biosystems)。無菌MF濾膜(REF:HAWP01300，直徑0.45 μm，美國Merck Millipore)、超聲碎裂儀(Bioruptor PLUS/pico，比利時(shí)Diagenode)、Illumina測序儀(HiSeq2500,美國Illumina)。

1.3 方法

1.3.1 皮膚微生物樣品的采集 采用無菌有齒鑷夾住無菌MF濾膜,緊貼受試者面頰部皮膚表面來回摩擦5～10次，隨即將此MF濾膜放入含有1 μL蛋白酶K和300 μL組織和細(xì)胞裂解液的無菌Eppendorf管中。設(shè)立3個未接觸皮膚的無菌MF濾膜為陰性對照。樣品保存于-80 ℃冰箱待用。

1.3.2 DNA提取及宏基因組測序 提取皮膚微生物DNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。采用超聲碎裂儀將總量約100 ng的DNA碎裂成長度為300～400 bp的DNA片段；采用KAPA LTP文庫純化試劑盒進(jìn)行DNA測序文庫的構(gòu)建。使用HiSeq PE Cluster V4試劑盒和HiSeq SBS V4 250 cycle試劑盒對DNA文庫進(jìn)行雙端測序。測序結(jié)束后利用軟件CASAVA v1.8.2 (美國Illumina)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Fastq格式的轉(zhuǎn)換。3個陰性對照的測序樣品亦同步進(jìn)行文庫構(gòu)建、測序及分析。樣品采集及DNA測序的方法參考Oh等[1]研究。測序由中山大學(xué)中山眼科中心魏來教授課題組完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用質(zhì)量控制軟件(FastQC, Cutadapt, Fastx, PrinSeq)對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，在得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)中去除來源于人細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)，得到不含有宿主數(shù)據(jù)的高質(zhì)量微生物數(shù)據(jù)，通過軟件HiSAT2 (v2.0.1)在通用微生物數(shù)據(jù)庫中比對該高質(zhì)量微生物數(shù)據(jù)，對成功匹配的微生物基因組進(jìn)行物種注釋，并采用RPKM法標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算相對豐度。物種構(gòu)成比=各物種的reads數(shù)目/總微生物reads×100%。采用R軟件(v3.4.3)分析基于菌種相對豐度的主成分分析(principal component analysis，PCA)，以PC1的數(shù)值計(jì)算β-多樣性的P值，間接反映組間物種相對豐度的差異。采用Mothur軟件計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(shannon index)以評估微生物α-多樣性，衡量微生物種類多樣性。采用線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)，通過Lefse程序計(jì)算組間差異微生物的相對豐度，獲得各組數(shù)據(jù)中具有代表性且差異顯著的菌種。由軟件bedtools (v2.19.1)計(jì)算獲得細(xì)菌基因組的覆蓋度(Coverage)。采用R軟件(v3.4.3)中的pROC腳本命令，利用各樣品中P.acnes的相對豐度計(jì)算ROC曲線，并依據(jù)ROC曲線的判定結(jié)果，假定當(dāng)P.acnes的相對豐度<80%時(shí)，皮膚微生態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)菌群失調(diào)。比較發(fā)生菌群失調(diào)的SD組樣品、未發(fā)生菌群失調(diào)的SD組樣品與健康組之間α-多樣性和β-多樣性的差異。

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。健康組和SD組間各微生物含量的比較、痤瘡丙酸桿菌相對豐度的比較、香農(nóng)指數(shù)及β-多樣性的比較采用t檢驗(yàn)；不同皮膚部位微生物結(jié)構(gòu)比較采用one-way ANOVA單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宏基因組測序分析健康組及SD組面部皮膚微生物數(shù)據(jù)

健康組樣品的總測序reads數(shù)據(jù)為42.2～67.2 M，源自人細(xì)胞的數(shù)據(jù)平均約占35.7%，每個樣品可獲得約3.2～13.4 M高質(zhì)量的微生物reads數(shù)目，占總測序reads數(shù)目的4.8%～26.6%。SD組樣品的總測序reads數(shù)據(jù)為28.1～84.6 M，源自人細(xì)胞的數(shù)據(jù)平均約占45.1%，每個樣品可獲得約1.9～20.4 M高質(zhì)量的微生物reads數(shù)目，占總測序reads數(shù)目的2.8%～34.6%。3個陰性對照的測序樣品均為重復(fù)、無效的數(shù)據(jù)或低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，且未獲得足夠的可用于分析的微生物數(shù)據(jù)，因此該數(shù)據(jù)不展示。

2.2 不同部位皮膚微生物PCA分析

分析SD好發(fā)部位皮膚的微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果示大部分無炎癥的皮膚組織之間的微生態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異(F=3.05,P=0.009)，而面部的3個不同部位，如臉頰、眉弓和鼻唇溝的微生態(tài)結(jié)構(gòu)最為相似(F=1.10，P=0.341)，見圖1A、1B。

圖1 不同SD好發(fā)部位(1A)及面部SD好發(fā)部位(1B)皮膚微生物的PCA分析(原始測序數(shù)據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫下載)

2.3 健康組與SD組面頰部皮膚微生物的組成比較

比較健康組與SD組之間面頰部皮膚微生物的相對組成，結(jié)果顯示，與健康組相比較，SD組的細(xì)菌相對含量下降(t=2.59,P=0.014)，而古生菌(t=2.23,P=0.033)與真菌(t=3.14,P=0.003)的相對含量升高，病毒的相對含量無明顯變化(P=0.091)，見圖2A。細(xì)菌的減少以P.acnes減少為主(t=2.69，P=0.012)，見圖2B。但SD組中細(xì)菌相對含量仍高達(dá)70.3%，為主要微生物(圖2C)。通過PCA分析兩組中各微生物的β-多樣性，結(jié)果顯示，相較于健康組，SD組細(xì)菌的β-多樣性發(fā)生改變(t=2.28，P=0.029)，而真菌(t=0.82，P=0.416)、病毒(t=0.16，P=0.870)的β-多樣性均無明顯差異(圖2D)。

2.4 SD患者皮損處的菌群失調(diào)及與健康組α-多樣性、β-多樣性比較

依據(jù)ROC曲線結(jié)果(圖3A)，SD組中有6個樣品出現(xiàn)菌群失調(diào)，與健康組(隨機(jī)選擇6個樣品)相比較，發(fā)生菌群失調(diào)的SD組樣品的細(xì)菌α-多樣性(t=3.14，P=0.011)和β-多樣性(t=5.34，P<0.001)均發(fā)生改變(圖3B、3C)；而未出現(xiàn)菌群失調(diào)的SD組樣品的細(xì)菌α-多樣性(t=1.98，P=0.060)和β-多樣性(t=1.56，P=0.133)與健康組無差異(圖3D、3E)。

2.5 SD患者皮損LDA分析

LDA分析發(fā)現(xiàn)在菌群失調(diào)的SD樣品中有36種細(xì)菌的相對含量較健康組升高(圖4A)。通過計(jì)算這36種細(xì)菌在各個樣品中的基因組覆蓋度，并結(jié)合ROC曲線的結(jié)果(表1)，當(dāng)基因組覆蓋度>1時(shí)，細(xì)菌在皮膚樣品中存在的可能性較大，結(jié)果顯示有7個共同的陽性致病菌，如S.aureus、S.epidermidis、S.haemolyticus、S.flexneri、肺炎支原體(Mycoplasmahyorhinis)、騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)和嗜熱厭氧桿菌(Thermusthermophilus)。

3 討論

2016年日本學(xué)者通過16S rRNA測序分析了SD皮損處微生物群落的變化，該研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬、鏈球菌屬和不動桿菌屬在SD患者中升高，而丙酸桿菌屬無明顯變化[14]。本研究通過宏基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬的細(xì)菌，如S.aureus、S.epidermidis和S.haemolyticus，在SD樣品中也升高，而丙酸桿菌屬的細(xì)菌如P.acnes反而減少。該結(jié)果產(chǎn)生的原因可能與16S rRNA在分析微生物群落的過程中不能精確到菌種的水平有關(guān)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，SD組皮膚細(xì)菌的相對豐度較健康組減少，以P.acnes的減少最為明顯。盡管如此，SD組的皮膚微生物仍以細(xì)菌為主。分析結(jié)果還顯示SD皮損處的細(xì)菌α-多樣性較健康

圖2 脂溢性皮炎患者皮損處存在細(xì)菌群落失調(diào) 2A: 健康組和SD組間微生物組成比較; 2B: 健康組和SD組P.acnes的相對豐度; 2C: SD組微生物的構(gòu)成比; 2D: 健康組和SD組間微生物的β-多樣性

Fig.2 Bacterial dysbiosis was found in SD lesion. 2A: Comparison of microbial composition between healthy group and SD group; 2B: Relative abundance ofP.acnesin healthy group and SD group; 2C: Microbial composition of SD group; 2D: Microbial β-diversity of healthy group and SD group.

圖3 菌群失調(diào)情況及相關(guān)α-和β-多樣性的變化 3A: ROC曲線判斷樣品是否存在菌群失調(diào)(ROC基于P.acnes的相對豐度計(jì)算; AUC: 曲線下面積); 3B: 菌群失調(diào)時(shí)健康組和SD組的α-多樣性; 3C: 菌群失調(diào)時(shí)健康組和SD組的β-多樣性；3D: 無菌群失調(diào)時(shí)健康組和SD組的α-多樣性; 3E: 無菌群失調(diào)時(shí)健康組和SD組的β-多樣性

圖4 脂溢性皮炎患者皮損處存在共同致病菌 4A: LDA分析,LDA數(shù)值>2的細(xì)菌被列出; 4B:各疾病樣品中共同的細(xì)菌

表1 ROC曲線評估SD組樣品的細(xì)菌基因組覆蓋度

組升高，提示細(xì)菌的種類發(fā)生改變；同時(shí)，細(xì)菌的β-多樣性亦發(fā)生改變，提示細(xì)菌的含量也發(fā)生了相應(yīng)改變。由于P.acnes是皮膚細(xì)菌群落中的主要細(xì)菌，疾病發(fā)生時(shí)對該菌的影響也較大[17-18]。分析顯示P.acnes的相對含量<80%，提示SD皮損處出現(xiàn)了菌群失調(diào)。

另一方面，過去一直認(rèn)為馬拉色菌是SD的主要致病菌[2-3]，臨床上使用抗真菌藥物可改善SD的相關(guān)癥狀[19]；但隨著宏基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)M.globosa是皮膚微生態(tài)結(jié)構(gòu)的正常真菌之一，且為主要的真菌[20-21]。同時(shí)，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)馬拉色菌及其亞種與SD無明顯相關(guān)性[22]。本研究中，健康組與SD組的真菌β-多樣性并無差異，這也側(cè)面說明了真菌的含量未發(fā)生改變。這一結(jié)果與Sandstrom等[22]的研究結(jié)果相似。因此，本研究認(rèn)為部分SD患者皮損處可出現(xiàn)菌群失調(diào)，但馬拉色菌是作為原發(fā)感染的病原體，還是作為菌群失調(diào)后繼發(fā)感染的病原體參與SD的發(fā)生，或該菌是否為SD的致病菌仍有待考究。

綜上所述，本研究采用宏基因組測序分析并比較了SD皮損和健康皮膚之間微生物的差異，發(fā)現(xiàn)SD皮損處存在菌群失調(diào)的現(xiàn)象，為后續(xù)進(jìn)一步研究SD奠定了基礎(chǔ)。由于患者面部的脂溢性皮炎在治療1周后未完全康復(fù)及在康復(fù)后未復(fù)診，本研究未能采集治療后患者面部的皮膚微生物樣品，未能全面展示面部微生物由健康到疾病、再恢復(fù)健康的整個過程，這將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。