姬濤，單玉剛，李懷平，馬宏偉，田小雪通訊作者）

（金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

0 引言

斑馬魚(Danio rerio)是一種簡單的生物實驗動物,具有和哺乳動物相似的生物結(jié)構(gòu)和生理功能。幾乎透明的胚胎、胚胎的體外發(fā)育以及與人類高達(dá)87%的基因相似性，使得斑馬魚被廣泛用于藥學(xué)領(lǐng)域的研究。模式動物斑馬魚在生態(tài)毒理學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。近年來，斑馬魚模型已拓展延伸至人類疾病動物模型、藥物代謝及藥物篩選研發(fā)等多個方面。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道[1-5]，斑馬魚模型在現(xiàn)代藥學(xué)研究中關(guān)于疾病動物模型、藥物活性篩選及代謝研究方向的研究取得了很大進(jìn)展。本實驗首次將斑馬魚模型用于評價抗霧霾作用，為其拓展應(yīng)用提供了參考。

1 資料與方法

1.1 實驗?zāi)康?。觀察評價金訶含片對斑馬魚腸蠕動的促進(jìn)作用，為金訶含片在抗PM2.5領(lǐng)域開發(fā)提供參考。

1.2 實驗動物。野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進(jìn)行。年齡為受精后5天，共210尾用于金訶含片對腸蠕動的促進(jìn)作用實驗，每實驗組為30尾斑馬魚。以上斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480-510 μS/cm；pH為6.9-7.2；硬度為53.7-71.6 mg/L CaCO3），實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.3 實驗藥物。金訶含片，棕色粉末，于2017年09月11日收樣，由金訶藏藥（山東）健康科技有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為50 mg/mL的母液，-20℃保存。臨用時用養(yǎng)魚水按需稀釋。金嗓子喉片，市售成品，棕褐色片劑，批號17031301，于2017年09月11日收樣，由山東金訶藥物研究開發(fā)有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為200 mg/mL的母液，-20℃保存。臨用時用養(yǎng)魚水按需稀釋。

1.4 儀器與試劑。解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）；6孔板（Fisher Scientific，China）；精密電子天平（CP214，奧豪斯）；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，Nikon，Japan）；尼羅紅（Sigma,China）；甲基纖維素（Sigma，China）。

1.5 濃度組別。實驗1組：模型對照組；實驗2組：金訶含片56 μg/mL；實驗3組：金訶含片167 μg/mL；實驗4組：金訶含片500 μg/mL；實驗5組：金嗓子喉片222μg/mL；實驗6組：金嗓子喉片667 μg/mL；實驗7組：金嗓子喉片2000 μg/mL。

1.6 濃度確定依據(jù)。根據(jù)金訶含片（對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為500 μg/mL）和金嗓子喉片（對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）大于2000 μg/mL）對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC），確定金訶含片對腸蠕動的促進(jìn)作用評價濃度設(shè)計為56 μg/mL（1/9 MTC）、167 μg/mL（1/3 MTC）和500 μg/mL（MTC）；金嗓子喉片對腸蠕動的促進(jìn)作用評價濃度設(shè)計為222 μg/mL（1/9 MTC）、667 μg/mL（1/3 MTC）和2000 μg/mL（MTC）。

1.7 模型制作。用養(yǎng)魚用水將尼羅紅配制成10 ng/mL溶液，把5 dpf AB品系斑馬魚放入其中16 h使斑馬魚將尼羅紅吞入腸道，建立斑馬魚腸蠕動評價模型。

1.8 實驗方法。隨機(jī)選取210尾受精后5天（5 dpf）野生型AB品系斑馬魚，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，水溶給予尼羅紅16 h建立斑馬魚腸蠕動評價模型。模型斑馬魚分別水溶給予金訶含片56、167、500 μg/mL濃度和金嗓子喉片222、667、2000 μg/mL濃度，同時設(shè)置模型對照組，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，每孔容量為3 mL。金訶含片和金嗓子喉片處理24 h后，每組隨機(jī)取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸腔中熒光染料信號強(qiáng)度、拍照并保存圖片，用尼康NIS-Elements D 3.10 高級圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計算斑馬魚腸腔熒光染料信號強(qiáng)度（S）進(jìn)行結(jié)果分析，評價金訶含片促進(jìn)腸道蠕動作用。腸蠕動促進(jìn)率計算公式如下：

用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05表明具有顯著性差異，提供具有代表性的實驗圖譜。

2 實驗結(jié)果

金訶含片在濃度為56、167和500 μg/mL時，斑馬魚腸腔熒光強(qiáng)度分別為562579、531775和343828像素，其腸蠕動促進(jìn)率分別為21.4%、25.7%和52.0%，與模型對照組（715433像素）比較，56 μg/mL濃度組P＞0.05，167 μg/mL濃度組P＜0.05，500 μg/mL濃度組P＜0.001，提示金訶含片在167和500 μg/mL濃度下對斑馬魚腸蠕動有促進(jìn)作用，詳情見表1。

表1 金訶含片各實驗組斑馬魚腸蠕動促進(jìn)率

金嗓子喉片在濃度為222、667和2000 μg/mL時，斑馬魚腸腔熒光強(qiáng)度分別為332834、323298和99571像素，其腸蠕動促進(jìn)率分別為53.5%、54.8%和86.1%，與模型對照組（715433像素）比較，222、667和2000 μg/mL濃度組P＜0.001，提示金嗓子喉片對斑馬魚腸蠕動有明顯的促進(jìn)作用，詳情見表2。

表2 金嗓子喉片各實驗組斑馬魚腸蠕動促進(jìn)率

3 實驗結(jié)論

在本實驗濃度條件下，于2017年09月11日提供的金訶含片和金嗓子喉片具有促進(jìn)斑馬魚腸蠕動的作用。根據(jù)上述實驗結(jié)果：在本實驗濃度條件下，金訶含片對斑馬魚的最大耐受濃度為500 μg/mL，金嗓子喉片對斑馬魚的最大耐受濃度大于2000 μg/mL。金訶含片對斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能有明顯的促進(jìn)作用，對斑馬魚腸蠕動也有促進(jìn)作用，對斑馬魚分泌納米活性炭進(jìn)入腸道有促進(jìn)趨勢。金嗓子喉片對斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能有明顯的促進(jìn)作用，對斑馬魚腸蠕動也有促進(jìn)作用，對斑馬魚分泌納米活性炭進(jìn)入腸道有促進(jìn)趨勢。