楊安平，顧斯穎，梁一俊，杜卓

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥工程學(xué)院，佛山 528000)

蝦青素(astaxanthin)為一種具有13個(gè)共軛雙鍵的酮式脂溶性類胡蘿卜素，主要存在于藻類、酵母、甲殼類動(dòng)物和魚類表皮中，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[1-2]，因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、水溶性差及生物利用度低等特點(diǎn)影響其應(yīng)用。有學(xué)者通過微囊化[3]、納米乳液化[4]等方法來改善其缺點(diǎn)，但效果不明顯。

脂質(zhì)體(liposome)是一種類似細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的雙分子層微小囊泡，藥物被脂質(zhì)體包裹后，可以提高藥物穩(wěn)定性，改善水溶性，增加生物利用度[5-7]。有學(xué)者將番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素等類胡蘿卜素成分通過制成脂質(zhì)體的方法[8-10]來改善其溶解性、穩(wěn)定性及生物利用度。劉媛等[11-12]使用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備蝦青素脂質(zhì)體用于皮膚傷口愈合的治療，但制備方法復(fù)雜，難以產(chǎn)業(yè)化。本研究擬采用乙醇注入法制備蝦青素脂質(zhì)體，探究其最佳處方與工藝并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1儀器 手掌式醫(yī)用離心機(jī)(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：XK-1200型)，超聲波清洗機(jī)(深圳鈺潔清洗設(shè)備有限公司，型號(hào)：F-060)，電子分析天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，型號(hào)：JJ124BF，d=0.1mg)，高效液相色譜儀(北京鋼臣科技有限公司，UV3000型紫外可見光檢測(cè)器，型號(hào)：LC3000)，柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司，型號(hào)：RPL-D2000)，納米粒度及ZETA電位儀(英國(guó)馬爾文公司，型號(hào)：NANO ZS90)。

1.2材料 蝦青素對(duì)照品(上海麥克林有限公司，含量：96%，批號(hào)：201424)，膽固醇[艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：B61251]，大豆磷脂[艾偉拓(上海)醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：SY-SI-180101]，甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司，色譜純)，純化水(實(shí)驗(yàn)室自制)，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1蝦青素脂質(zhì)體的制備 稱取處方量的磷脂、膽固醇、蝦青素溶入10 mL乙醇中，用注射器勻速緩慢注入水合介質(zhì)(0.01 mol·mL-1磷酸鹽緩沖液)中，恒溫水浴加熱，并攪拌至乙醇完全蒸發(fā)，超聲10 min，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得橙紅色澄清透明的蝦青素脂質(zhì)體液體，冰箱4 ℃冷藏避光保存。

2.2處方設(shè)計(jì)與篩選 以脂質(zhì)體包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)，觀察脂藥比、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比、水合介質(zhì)pH值、水合介質(zhì)用量、溫度5個(gè)因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響，選出影響脂質(zhì)體包封率的最不明確4個(gè)因素、3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選最佳處方與工藝，并按最優(yōu)處方與工藝制備蝦青素脂質(zhì)體5批。

2.3含量測(cè)定

2.3.1色譜條件 參考文獻(xiàn)[13]的方法，色譜柱為Kromasil(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(95：5)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為475 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取蝦青素對(duì)照品5 mg，用甲醇溶解并定容在50 mL棕色量瓶中，得0.1 mg·mL-1蝦青素對(duì)照品母液。精密吸取不同量的蝦青素對(duì)照品母液，制成0.001，0.002，0.003和0.004 mg·mL-1的蝦青素溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以蝦青素溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=228 860 150X+14 761.2(R2=0.999)。

2.3.3包封率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14]介紹的方法，吸取制備好蝦青素脂質(zhì)體液體1mL，用甲醇稀釋至10 mL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算蝦青素的濃度(C0)；吸取制備好蝦青素脂質(zhì)體液體1mL，用甲醇稀釋至10 mL，超聲破乳2 min，以10 000 r·min-1離心10 min(r=1.8 cm)，取上清液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算蝦青素的濃度(C1)，根據(jù)下式計(jì)算包封率(EE)：EE(%)=(C1/C0)×100%。式中，C1為包封在脂質(zhì)體中的蝦青素質(zhì)量濃度，C0為脂質(zhì)體中蝦青素的總質(zhì)量濃度。

2.4最優(yōu)處方蝦青素脂質(zhì)體的表征檢測(cè)

2.4.1蝦青素脂質(zhì)體形態(tài) 取最優(yōu)處方蝦青素脂質(zhì)體加水合介質(zhì)稀釋250倍，吸取適量樣品至碳支持膜的銅網(wǎng)，滴加2%磷鎢酸負(fù)染，晾干，透射電鏡拍攝不同放大倍數(shù)下的蝦青素脂質(zhì)體，并觀察蝦青素脂質(zhì)體的顯微形態(tài)。

2.4.2蝦青素脂質(zhì)體粒徑 取最優(yōu)處方蝦青素脂質(zhì)體加水合介質(zhì)稀釋100倍，在室溫25 ℃下，使用NANO ZS90 納米粒度儀測(cè)得蝦青素脂質(zhì)體的平均粒徑和粒徑分布。

3 結(jié)果

3.1單因素篩選實(shí)驗(yàn)

3.1.1脂藥比對(duì)包封率的影響 按“2.1”項(xiàng)的方法制備蝦青素脂質(zhì)體，其他條件不變，考察脂藥比分別為10：1，20：1，30：1，40：1，50：1時(shí)對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。結(jié)果顯示，不同脂藥比所得的脂質(zhì)體包封率分別為11.24%，14.68%，18.01%，19.46%，19.01%，結(jié)果見圖1。

圖1 脂藥比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.1 Effect of the ratio of lipids to astaxanthin on the encapsulation efficiency of the liposome

3.1.2磷脂與膽固醇的質(zhì)量比對(duì)包封率的影響 按“2.1”項(xiàng)的方法制備蝦青素脂質(zhì)體，其他條件不變，考察磷脂與膽固醇質(zhì)量比分別為25：1，20：1，15：1，10：1，5：1時(shí)對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。結(jié)果顯示，不同磷脂與膽固醇質(zhì)量比所得的脂質(zhì)體包封率分別為14.95%，15.34%，20.38%，18.45%，18.30%，結(jié)果見圖2。

圖2 磷脂與膽固醇的質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 Effect of the ratio of phospholipid to cholesterol on the encapsulation efficiency of the liposome

3.1.3水合介質(zhì)pH值對(duì)包封率的影響 按“2.1”項(xiàng)的方法制備蝦青素脂質(zhì)體，其他條件不變，考察水合介質(zhì)pH值分別為6.0，6.5，7.0，7.4，8.0時(shí)對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。結(jié)果顯示，不同水合介質(zhì)pH值所得的脂質(zhì)體包封率分別為19.42%，19.86%，22.26%，20.87%，18.44%，結(jié)果見圖3。

圖3 水合介質(zhì)pH值對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.3 Effect of pH value of hydration medium on the encapsulation efficiency of the liposome

3.1.4水合介質(zhì)用量對(duì)包封率的影響 按“2.1”項(xiàng)的方法制備蝦青素脂質(zhì)體，其他條件不變，考察水合介質(zhì)用量分別為10，20，30，40，50 mL時(shí)對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。結(jié)果顯示，不同水合介質(zhì)用量所得的脂質(zhì)體包封率分別為7.12%，19.13%，18.10%，16.56%，15.10%，結(jié)果見圖4。

圖4 水合介質(zhì)用量對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.4 Effect of the amount of hydration medium on the encapsulation efficiency of the liposome

3.1.5溫度對(duì)包封率的影響 按“2.1”項(xiàng)方法制備蝦青素脂質(zhì)體，其他條件不變，考察水浴溫度分別為45，50，55，60，65 ℃時(shí)對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。結(jié)果顯示，不同水合介質(zhì)溫度所得的脂質(zhì)體包封率分別為15.62%，19.76%，22.46%，22.37%，15.58%，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.5 Effect of temperature on the encapsulation efficiency of the liposome

3.2正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇脂藥比(A)、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(B)、水合介質(zhì)pH值(C)、溫度(D)4個(gè)因素，各選取3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1～3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab.1 Levels and factors of orthogonal test

由表2直觀分析與表3方差分析可知，極差R的大小順序?yàn)椋篋(溫度)>B(磷脂與膽固醇的質(zhì)量比)>C(水合介質(zhì)pH值)>A(脂藥比)，由于因素A的極差與離差平方和最小，作為誤差項(xiàng)，經(jīng)過方差分析，因素A(脂藥比)、C(水合介質(zhì)pH值)、D(溫度)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定蝦青素脂質(zhì)體制備處方與工藝為A2B1C2D3，即脂藥比40：1，磷脂與膽固醇的質(zhì)量比20：1，水合介質(zhì)pH值為7.0，溫度為60 ℃。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of orthogonal test

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析 Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

3.3最佳工藝驗(yàn)證 精密稱量磷脂 80 mg、膽固醇4 mg、蝦青素2 mg，溶入10 mL乙醇中，用注射器勻速緩慢注入0.01 mol·mL-1磷酸鹽緩沖液20 mL中，60 ℃恒溫水浴加熱，攪拌至乙醇完全蒸發(fā)，超聲10 min，用孔徑0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得橙紅色澄清透明的蝦青素脂質(zhì)體液體，重復(fù)制備5批次，并測(cè)定脂質(zhì)體批次包封率分別為33.68%，35.62%，35.74%，34.96%，36.42%，平均包封率為(35.28±0.93)%。

3.4最優(yōu)處方蝦青素脂質(zhì)體的表征檢測(cè)

3.3.1形態(tài)觀察 按最優(yōu)處方制備蝦青素脂質(zhì)體在1 μm的標(biāo)尺下可觀察到許多類球形的物質(zhì)，分布均勻，結(jié)果見圖6；放大到200 nm的標(biāo)尺，可清晰觀察到脂質(zhì)體的形態(tài)，外層包裹內(nèi)層，結(jié)果見圖7。

圖6 蝦青素脂質(zhì)體透射電鏡圖(標(biāo)尺：1 μm)Fig.6 Transmission electron microscope image of astaxanthin liposome(Scale：1 μm)

3.3.2粒徑檢測(cè) 按最優(yōu)處方與工藝制備蝦青素脂質(zhì)體的平均粒徑為143.2 nm，PDI值為0.199，粒徑大小分布呈正態(tài)分布，見圖8。

圖8 蝦青素脂質(zhì)體的粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of of astaxanthin liposome

4 討論

蝦青素的化學(xué)名稱為3，3'-二羥基-4，4-二酮基-β，β'-胡蘿卜素，由位于兩側(cè)的羥基和羰基取代的紫羅蘭酮環(huán)和中間多聚烯鏈組成，具有多個(gè)共軛雙鍵的萜烯基團(tuán)化合物，對(duì)光、氧、溫度等因素極易敏感，容易發(fā)生全反式蝦青素向9-順式或13-順式異構(gòu)體反應(yīng)與環(huán)氧化、羥基化化學(xué)降解反應(yīng)而出現(xiàn)褪色、生物活性降低、甚至失去生物活性等[15]。此外，蝦青素不溶于水，也影響其生物利用度。為了提高穩(wěn)定性、改善溶解性、提高生物利用度，已有研究將蝦青素制成脂溶性制劑、包合物、微囊、納米制劑等[16]。

脂質(zhì)體是一種將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體。藥物被包裹后，與外界氧、光隔離，可增加藥物的穩(wěn)定性，同時(shí)，藥物制成脂質(zhì)體后，脂質(zhì)體的粒徑較小，特別是粒徑小于100 nm的納米脂質(zhì)體，易分散在水中，對(duì)藥物起到增溶效果。因此，將蝦青素制成脂質(zhì)體，在穩(wěn)定性、溶解度和生物利用度方面會(huì)有效改善。脂質(zhì)體的制備方法主要有乙醇注入法、反向蒸發(fā)法、薄膜分散法、超聲分散法、冷凍干燥法、超臨界二氧化碳法、微乳法、薄膜擠壓-硫酸銨梯度法、薄膜分散-機(jī)械振蕩法等[17]，其中乙醇注入法操作簡(jiǎn)便，不使用毒性較大的有機(jī)試劑，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究采用乙醇注入法制備的蝦青素制成脂質(zhì)體平均粒徑為143.2 nm，雖大于100 nm，但在水中也是易均勻分散，同時(shí)通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，蝦青素制成脂質(zhì)體后在50 ℃水浴加熱3 h的降解率為3.36%，比游離蝦青素在50 ℃水浴加熱3 h的降解率33.82%提高近10倍，本實(shí)驗(yàn)研究制備的蝦青素脂質(zhì)體包封率僅約為35.28%，還有很大提升空間。下一步可繼續(xù)研究，將蝦青素脂質(zhì)體制成凍干制劑，解決液態(tài)脂質(zhì)體易發(fā)生聚集、融合、磷脂氧化，最終導(dǎo)致包裹的藥物泄露的穩(wěn)定性差問題[18]，增加蝦青素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，結(jié)合超聲制備出粒徑更小、包封率更大的蝦青素脂質(zhì)體，推動(dòng)其市場(chǎng)應(yīng)用。