于秋菊，王曉麗

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，徐州 221006；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210018)

酮洛芬主要用于治療風(fēng)濕性、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和強直性脊椎炎等[1]。目前，國內(nèi)外上市的劑型主要有片劑、膠囊劑、注射劑、栓劑、外用洗劑等。酮洛芬由于溶解度小，口服生物利用度低且長期服用會導(dǎo)致胃腸道刺激性[2]。經(jīng)皮給藥制劑的研究表明，其可以避免肝臟首關(guān)效應(yīng)及胃腸道刺激性[3-4]。筆者通過對酮洛芬在不同pH值條件下的體外透皮速率研究，考察pH值條件對藥物透皮速率及滲透系數(shù)間的關(guān)系，以指導(dǎo)酮洛芬微乳凝膠[5]的制備。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；精密酸堿計(HM-60G)；藥物透皮擴散實驗儀(RYJ-12B)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-B88)；精密數(shù)顯恒溫水浴鍋(J-HH-6A)；電子天平(千分之一，F(xiàn)A2204B)；超聲波清洗器(US-22D)。

1.2藥品與試劑 酮洛芬對照品(上海順勃生物工程有限公司，批號：100177，含量：99.9%)；酮洛芬原料藥(批號：160601，含量：99.54%，武漢祥和精細(xì)化工有限公司)；甲醇(一級色譜純)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸、正辛醇、無水乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇、氫氧化鈉均為分析純。

1.3動物 豚鼠(徐州醫(yī)科大學(xué)提供，批號：170622，豚鼠體質(zhì)量約300 g)。動物許可證號：SCXK(蘇)2012-0002，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～25 ℃，濕度45%～55%，光照100 lx，給予豚鼠生長繁殖飼料，每天飲水2次。

2 方法與結(jié)果

2.1分析方法的建立

2.1.1色譜條件及專屬性實驗 參照文獻(xiàn)[6]介紹的高效液相色譜(HPLC)法，結(jié)合酮洛芬理化性質(zhì)，通過實驗篩選出酮洛芬的色譜條件為：色譜柱：COSMOSIL 3C18-EB柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：pH值4.5磷酸鹽緩沖液：甲醇=(18：72)；檢測波長：258 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述條件下，酮洛芬的保留時間約為7.1 min，柱效≥5000，空白不干擾藥物測定。酮洛芬的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 空白與酮洛芬對照品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of blank solution and ketoprofen control

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取的酮洛芬原料藥0.005 0 g，置50 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為100 μg·mL-1的儲備液。精密量取儲備液1.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL分別置20 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.45 μm濾膜濾過，按濃度由低到高進(jìn)樣分析。以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為A=136.04C-45.003，r=0.999 2。結(jié)果表明：酮洛芬在5.0～50 μg·mL-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.3分析方法的確證 精密度實驗：分別量取酮洛芬對照品儲備液適量，配制酮洛芬線性范圍內(nèi)低、中、高3個濃度(約8.0，24.0，48.0 μg ·mL-1)的樣品，于日內(nèi)分別連續(xù)進(jìn)樣3次，測定不同樣品的濃度，結(jié)果RSD值分別為1.94%，1.19%，1.08%，均小于2.0%，說明精密度良好。

穩(wěn)定性實驗：精密量取儲備液3.2 mL，置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.45 μm濾膜濾過，取20 μL續(xù)濾液分別于0，2，4，8，12，24 h測定峰面積，代入回歸方程求出濃度，結(jié)果顯示，RSD值為1.75%，即24 h內(nèi)含量測定結(jié)果穩(wěn)定。

回收率實驗：精密量取儲備液1.0，3.0，5.0 mL，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)孔徑0.45 μm濾膜濾過，后用進(jìn)樣針取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣分析，以測得量與加入量比較，計算回收率，結(jié)果平均回收率分別為101.9%，102.69%，100.21%，RSD值分別為1.67%，1.51%，0.73%，表明回收率符合方法學(xué)要求。

2.2酮洛芬理化性質(zhì)的測定

2.2.1溶解度的測定 為了研究pH值對酮洛芬透皮吸收的影響，本實驗測定了酮洛芬在不同pH值條件下的溶解度[溫度(32±1) ℃]，由于酮洛芬為一弱酸性藥物，故而選擇緩沖液的pH值分別為5.4，6.8，7.4，8.0，9.0。結(jié)果見圖2。

圖2 酮洛芬在不同pH值PBS中平衡溶解度比較(n=3)Fig.2 Equilibrium solubility of ketoprofen in PBS with different pH value(n=3)

由圖2可知，酮洛芬的溶解度隨著pH值的升高呈遞增趨勢，但在pH值8.0條件下小于pH值7.4的溶解度，可能是由于酮洛芬分子結(jié)構(gòu)中同時帶有羰基和羧基，但當(dāng)處于pH值9.0的堿性環(huán)境中時，由于溶劑離子化效應(yīng)增大，其溶解度又有所增高。

2.2.2酮洛芬表觀油水分配系數(shù)(P)的測定 制備酮洛芬的飽和正辛醇溶液，精密量取該溶液2 mL置于具塞試管中，分別加入被正辛醇飽和過的純化水、pH值5.0，6.8，7.4，8.0，9.0的緩沖液5.0 mL后，放入振蕩器中，水浴溫度(32±1) ℃，避光振搖24 h。離心，分離。分取上、下層溶液各10 μL進(jìn)樣，測定酮洛芬在水相(Cw)及油相中的濃度(Co)[7]。油水分配系數(shù)P用下式計算：

P=Co/Cw (1)

當(dāng)采用不同pH值磷酸鹽緩沖液為水相時，酮洛芬的P見圖3所示。

圖3表明，以純化水為水相時，32 ℃下，酮洛芬在正辛醇/水體系中的油水分配系數(shù)為1.604，較小。隨著水相pH值的增加，酮洛芬的油水分配系數(shù)迅速下降，可能是由于當(dāng)藥物以分子型存在時在水中的溶解度較小，油中溶解度較大，因為酮洛芬的解離常數(shù)為5.3，與5.4較為接近，也就是說酮洛芬在pH值為5.4的緩沖液中分子型比例最大，故而油水分配系數(shù)較大，且隨著pH值的增加分子型比例逐漸減小，故而其油水分配系數(shù)隨著pH值的增加而逐漸降低，在pH值為9.0時又有些微上升。

圖3 酮洛芬在不同pH值磷酸鹽緩沖液-正辛醇體系中的油水分配系數(shù)Fig.3 P value of ketoprofen in the system of phosphate buffer with different pH and n-octanol

2.3體外經(jīng)皮滲透實驗

2.3.1皮膚的選擇與處理 取健康豚鼠，處死后剝離腹部皮膚，在0.4%硫化鈉溶液中浸泡2 h，小心除去表面毛發(fā)及皮下脂肪、粘連的結(jié)締組織等，繼續(xù)在0.9%氯化鈉溶液中浸泡30 min，清洗3遍，于-20 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

2.3.2接受液的篩選 由于酮洛芬在pH值7.4溶液中溶解度最大，但為了更好地滿足漏槽條件[9]，在該緩沖鹽中加入20%乙醇、20%丙二醇和20%聚乙二醇，以提高酮洛芬的溶解度，測量方法同“2.2.1”，結(jié)果酮洛芬的溶解度分別為852.34，631.67，428.46 μg ·mL-1。

可見，加入乙醇使溶解度增加較為顯著，原因可能是乙醇為小分子且含有一個羥基，可部分與酮洛芬中的羧基結(jié)合為酯，從而大大增加溶解度。故選擇20%乙醇-pH值7.4緩沖液作為接受液。

2.3.3累積滲透量的測定 本實驗中，累積滲透量(Q)按公式(2)計算[10-11]：

cn為第n個取樣點濃度，ci為第i個取樣點濃度，A為擴散池面積，6.5為接收池容積。以Q為縱坐標(biāo)，時間t為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，所得直線的斜率即為穩(wěn)態(tài)滲透速率常數(shù)Js[12]( μg·cm2·h-1)。將Js除以酮洛芬在擴散池中藥物的平衡濃度Cd( μg·mL-1)(由相應(yīng)pH值時的溶解度轉(zhuǎn)換出)可求得表觀經(jīng)皮滲透系數(shù)Ps(cm·h-1)，如公式(3)所示，

Ps=Js/Cd(3)

結(jié)果見表1。

表1 酮洛芬在不同pH值的體外透皮吸收動力學(xué)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of kinetics parameters of ketoprofen in vitro transdermal absorption at different pH value

由表1可知，在pH值為7.4時，酮洛芬的Js和Ps最大，且與其溶解度成正比，與油水分配系數(shù)成反比，由此可見，pH值對酮洛芬透皮滲透性影響較大，藥物溶解和擴散程度決定了藥物經(jīng)皮滲透的速率與程度。

2.4多元線性回歸分析

2.4.1回歸方程的假設(shè)檢驗及評價 以Js為因變量，pH值、S、P作為自變量，利用SPSS19.0版統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行多元線性回歸分析。結(jié)果模型的R=1.000，R方=0.999，調(diào)整R方=0.997，標(biāo)準(zhǔn)估計的誤差=5.884 773，P=0.034<0.05，表明所建方程有統(tǒng)計學(xué)意義?；貧w模型方差分析結(jié)果見表2。

表2 回歸模型方差分析結(jié)果Tab.2 Results of variance analysis of regression model

由表2可知，所建立模型的變量均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4.2多元線性回歸方程的建立 方法同“2.4.1”項。結(jié)果見表3，可得到多元線性回歸方程的回歸系數(shù)。

表3 各因素回歸系數(shù)Tab.3 Regression coefficient of each factors

自變量pH值的β1=-0.268，S的β2=1.099，P的β2=-0.141，即3個自變量對因變量Js的影響作用大小為S>pH>P。由多元線性回歸得出的線性回歸方程為Js=-19.635pH+1.686S-5.116P+92.121(n=5，R=1.000，s=5.885)，R=1.000，表示數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性較好。

3 討論

本實驗通過測定酮洛芬在不同pH值PBS溶液中的溶解度及油水分配系數(shù)，并通過考察酮洛芬在不同溶媒中的溶解度，確定滿足漏槽條件的接受液，通過測定酮洛芬在不同pH值PBS溶液中的體外透皮特性。結(jié)果表明，pH值對酮洛芬的理化性質(zhì)與體外透皮性能均有很大影響，在pH值為7.4的PBS溶液中，酮洛芬可獲得較高的溶解度、脂溶性及皮膚通透性，為酮洛芬微乳凝膠的制備奠定實驗基礎(chǔ)。

本研究回歸分析結(jié)果表明，多元線性回歸模型基本可以用于預(yù)測分析pH值、S、P與藥物滲透活性的變化趨勢，可以計算獲得最佳pH值、S、P，可以通過輔料的加入改變藥物的pH值，以調(diào)節(jié)酸式體與堿式體的存在比例，以改善藥物的透皮吸收。