趙洪 李靜 向旭 高禮安 鄧功成
摘要:采用液體發(fā)酵技術(shù)和正交試驗(yàn)方法,研究碳源、氮源、起始pH值和發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件對(duì)紅汁乳菇菌絲體干質(zhì)量的影響,并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵條件的較優(yōu)組合為碳源為馬鈴薯粉,濃度為3%;氮源為酵母膏,濃度為0.3%;起始pH值為6.0;發(fā)酵時(shí)間5 d。在27 ℃條件下,該組合菌絲體干質(zhì)量最高,為10.094 g/L。
關(guān)鍵詞:紅汁乳菇;菌絲體;液體發(fā)酵;工藝優(yōu)化;正交試驗(yàn)
中圖分類(lèi)號(hào): S646.04? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2020)14-0167-03
紅汁乳菇(Lactarius hatsutake),別稱(chēng)紫菌、松毛菌,屬擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina) 層菌綱(Hymenomycetes) 傘菌目(Agaricales) 紅菇科(Russulaceae)乳菇屬(Lactartus)大型真菌[1]。紅汁乳菇為菌根食用菌,目前尚不能人工栽培。紅汁乳菇菌絲體可以與馬尾松等植物形成菌根[2],對(duì)松樹(shù)的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,可提高松樹(shù)抗環(huán)境脅迫能力已得到普遍認(rèn)同。有研究者對(duì)紅汁乳菇子實(shí)體的生境及發(fā)生規(guī)律開(kāi)展了調(diào)查和研究[3-5],對(duì)其子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定[6]。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)對(duì)紅汁乳菇菌絲體的營(yíng)養(yǎng)特性和單因子生長(zhǎng)條件等進(jìn)行了研究[7-8]。采用液體發(fā)酵技術(shù)是獲得紅汁乳菇菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物的重要手段,探索液體發(fā)酵條件對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響,可為大規(guī)模的菌絲體生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1 菌株 紅汁乳菇由黔南民族師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL。完全培養(yǎng)基(液體)配方:葡萄糖2.000%,蛋白胨0.200%,磷酸二氫鉀0.046%,磷酸氫二鉀0.100%,硫酸鎂0050%,維生素B1 0.003 mg/100 mL,pH值6.5。液體種子培養(yǎng)基配方同PDA培養(yǎng)基,但不加瓊脂。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 種子制備 斜面種子(一級(jí)種)制備:將采集的新鮮子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室,采用組織分離法獲得母種,經(jīng)轉(zhuǎn)接獲得一級(jí)種。液體種子制備:用 250 mL 三角瓶,裝入100 mL液體種子培養(yǎng)基,在無(wú)菌條件下接入約5 mm×5 mm紅汁乳菇一級(jí)種1塊,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi),于27 ℃,150 r/min條件下培養(yǎng)5 d,制成液體菌種。
1.2.2 紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵單因子試驗(yàn)
1.2.2.1 紅汁乳菇菌絲體的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 用250 mL三角瓶作培養(yǎng)容器,裝入100 mL完全培養(yǎng)基,常規(guī)高壓滅菌后,在無(wú)菌條件下接入10 mL液體菌種,置恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi),于27 ℃,150 r/min條件下培養(yǎng),接種培養(yǎng)1 d后,每天取3瓶,測(cè)量菌絲體干質(zhì)量和發(fā)酵液的pH值。
1.2.2.2 碳源篩選試驗(yàn) 分別用山梨醇(單糖),麥芽糖、蔗糖(雙糖),玉米粉、馬鈴薯粉(多糖)代替完全培養(yǎng)基中的葡萄糖,篩選不同碳源對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理(包括葡萄糖),3次重復(fù)。
1.2.2.3 氮源篩選試驗(yàn) 分別用酵母膏、尿素、甘氨酸(有機(jī)氮),氯化銨、硫酸銨、硝酸銨(無(wú)機(jī)氮)代替完全培養(yǎng)基中的蛋白胨,篩選不同氮源對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理(包括蛋白胨),3次重復(fù)。
1.2.2.4 發(fā)酵起始pH值試驗(yàn) 采用完全培養(yǎng)基,設(shè)置pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0等6個(gè)處理,3次重復(fù),用10% NaOH和10% HCl調(diào)節(jié)pH值,觀(guān)測(cè)不同發(fā)酵起始pH值對(duì)紅汁乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響。
1.2.3 菌絲體液體發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因子試驗(yàn)的結(jié)果,采用L9(34)正交試驗(yàn)[9],優(yōu)化液體發(fā)酵條件。
1.2.4 試驗(yàn)測(cè)定方法 發(fā)酵液用滌綸布過(guò)濾,放入60 ℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)烘48 h,用電子天平稱(chēng)量菌絲的干質(zhì)量;用精密pH試紙、pHS-25A型數(shù)字酸度計(jì)同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。
2 結(jié)果與分析
2.1 紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵單因子試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 紅汁乳菇菌絲體的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),菌絲干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制菌絲體的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。由圖1可以看出,紅汁乳菇菌絲體的生長(zhǎng)過(guò)程,基本上與種群在有限環(huán)境中連續(xù)增長(zhǎng)的邏輯斯諦曲線(xiàn)相符合[10],1~2 d為增長(zhǎng)的開(kāi)始期,2~3 d 為加速期,5~7 d為飽和期,5 d時(shí)菌絲干質(zhì)量最高。因此,其菌絲體的液體培養(yǎng)時(shí)間為5 d即可。
液體發(fā)酵體系中pH值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),由發(fā)酵初始時(shí)的6.5降至4左右(圖2),這可能是發(fā)酵代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸導(dǎo)致的。
2.1.2 碳源對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響 由表1可知,紅汁乳菇菌絲體對(duì)碳源的利用較廣,單糖、雙糖和多糖都可以利用。在供試的碳源中,對(duì)葡萄糖的利用最好,發(fā)酵液菌絲干質(zhì)量最高,達(dá) 8.082 g/L;其次為馬鈴薯粉,發(fā)酵液菌絲干質(zhì)量為7.391 g/L;山梨醇最差。對(duì)不同供試碳源處理的菌絲干質(zhì)量進(jìn)行方差分析可知,葡萄糖與麥芽糖、蔗糖、山梨醇等碳源差異顯著,但與馬鈴薯粉、玉米粉沒(méi)有顯著差異,若進(jìn)行規(guī)?;a(chǎn),從經(jīng)濟(jì)成本考慮可選擇馬鈴薯粉或玉米粉作為紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵的碳源。
2.1.3 氮源對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響 由表2可知,紅汁乳菇菌絲體對(duì)供試的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮都能利用。在供試的氮源中,對(duì)酵母膏的利用最好,發(fā)酵液菌絲干質(zhì)量達(dá)7.155 g/L,其次為蛋白胨,對(duì)甘氨酸的利用最差。對(duì)不同供試氮源處理的菌絲干質(zhì)量進(jìn)行方差分析可知,供試的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮的一些種類(lèi)之間,發(fā)酵液的菌絲干質(zhì)量差異不顯著,表明紅汁乳菇菌絲體對(duì)氮源的利用較廣泛。
2.1.4 發(fā)酵起始pH值對(duì)紅汁乳菇菌絲體生長(zhǎng)的影響 由表3可知,紅汁乳菇菌絲體對(duì)發(fā)酵環(huán)境的pH值適應(yīng)范圍較廣,液體發(fā)酵的起始pH值在 3.0~8.0都能生長(zhǎng)。培養(yǎng)6 d后,發(fā)酵起始pH值為5.0的處理菌絲體的干質(zhì)量最大,為7.283 g/L。這說(shuō)明紅汁乳菇菌絲體在中性或偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)較好。
2.2 紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵條件優(yōu)化
根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果,綜合考慮原料的成本,試驗(yàn)選擇馬鈴薯粉作為碳源,酵母膏作為氮源。選擇馬鈴薯粉濃度(A)、酵母膏濃度(B)、pH值(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)等4因子進(jìn)行 L9(34) 正交試驗(yàn),用菌絲體干質(zhì)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。
從表5可以看出,處理9發(fā)酵條件組合的菌絲體干質(zhì)量最高。表明菌絲液體發(fā)酵較為優(yōu)化的發(fā)酵條件為A3B3C2D1,即碳源馬鈴薯粉濃度為3%,氮源酵母膏濃度為0.3%,起始pH值為6.0,發(fā)酵時(shí)間5 d。碳源馬鈴薯粉R=4.552,為最大,表明碳源對(duì)液體發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量的影響較其他發(fā)酵因子大,是影響紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵干質(zhì)量的關(guān)鍵性因子。
3 結(jié)論與討論
紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵對(duì)碳源的利用較廣,葡萄糖是供試碳源中菌絲干質(zhì)量最高的碳源,符合真菌對(duì)碳營(yíng)養(yǎng)需求的一般特征,本試驗(yàn)以馬鈴薯粉、玉米粉作供試碳源,雖菌絲干質(zhì)量沒(méi)有葡萄糖高,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析其與葡萄糖無(wú)顯著差異,若進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn),從經(jīng)濟(jì)成本考慮可選擇馬鈴薯粉或玉米粉作紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵的碳源。紅汁乳菇菌絲體對(duì)氮源的利用較廣泛,對(duì)供試的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮都能利用,對(duì)酵母膏的利用最好,其次為蛋白胨,可用它們作為紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵的氮源。紅汁乳菇菌絲體對(duì)發(fā)酵環(huán)境的起始pH適應(yīng)范圍較廣,但菌絲體在中性或偏酸性的環(huán)境中生長(zhǎng)較好,說(shuō)明紅汁乳菇菌絲體充分適應(yīng)了我國(guó)南方酸性的土壤環(huán)境。
本研究表明,紅汁乳菇菌絲體液體發(fā)酵條件的較優(yōu)組合為馬鈴薯粉作碳源,濃度為3%;酵母膏作氮源,濃度為0.3%;起始pH值為6.0;發(fā)酵時(shí)間為5 d。在27 ℃溫度條件下,菌絲體干質(zhì)量最大,達(dá)10.094 g/L。
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收稿日期:2019-08-23
基金項(xiàng)目:貴州省科學(xué)技術(shù)基金[編號(hào):黔科合LH字(2014)7425]。
作者簡(jiǎn)介:趙 洪(1968—),男,貴州甕安人,副教授,主要從事生態(tài)學(xué)教學(xué)和環(huán)境生態(tài)及資源開(kāi)發(fā)研究。E-mail:732140126@qq.com。