吳汶豐，張澤鑫，梁一飛， 王家爵，楊賢平，裴悅，李紅毅

(1.廣州中醫(yī)院大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405； 2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510105)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種慢性、復發(fā)性、炎癥性皮膚病，臨床以瘙癢和反復發(fā)作的濕疹樣皮損為特征。目前，AD治療仍以局部應(yīng)用潤膚劑和糖皮質(zhì)激素為基礎(chǔ)，輔以鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、抗微生物制劑等[1]。長期使用糖皮質(zhì)激素會帶來皮膚及全身各系統(tǒng)的副作用。中醫(yī)藥基于整體觀念和辨證論治原則，具有療效顯著、副作用小、遠期療效佳等優(yōu)點。培土清心方治療特應(yīng)性皮炎臨床療效確切，該方治療AD 3個月后SCOARD評分有顯著意義的下降[2]。

廣東省中醫(yī)院陳達燦教授，擁有豐富的臨床經(jīng)驗，提出AD的主要病機為“脾失健運，心火亢盛”，嬰幼兒先天稟賦不足，脾胃虛弱為本，脾虛濕生，郁而化熱，子病及母，心火亢盛為標，本虛標實，濕熱郁結(jié)肌膚，發(fā)為本病?！芭嗤燎逍姆健弊鳛殛愡_燦教授治療AD的驗方，方含太子參、燈芯草、淡竹葉、甘草、連翹、白術(shù)、山藥、薏苡仁、鉤藤、牡蠣。連翹與太子參共為君藥，連翹清熱解毒，消癰散結(jié)，長于清心瀉火。太子參補氣生津，為補氣藥中清補之品，共奏培土清心之效；輔以臣藥山藥、白術(shù)、薏苡仁健脾除濕、平補脾胃；燈芯草和淡竹葉，利尿除煩清心火。佐藥為牡蠣、鉤藤，功能潛陽益陰、清心降火，甘草培土且調(diào)和諸藥。諸藥合用，可達培土清心、安神止癢之功[3]。目前認為培土清心方主要通過干預IL-4，IL-10，INF-γ等因子及淋巴細胞調(diào)節(jié)免疫失衡狀態(tài)發(fā)揮作用[4]，但進一步的信號通路、基因等作用機制目前尚不明確。

GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO),收錄了生物學領(lǐng)域大量的高通量實驗數(shù)據(jù)，且提供多種疾病的基因表達譜信息。通過生物信息學分析，能夠有效挖掘其潛在價值，篩選出與疾病發(fā)展密切聯(lián)系的差異基因[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學是結(jié)合文本挖掘和數(shù)據(jù)庫分析的新興藥物研究方法，可全面展示藥物、靶點與疾病之間的關(guān)系。中藥復方由于其多成分、多靶點、多途徑的作用特點，作用機制的探索一直是其研究熱點和難點，但網(wǎng)絡(luò)藥理學的全面分析可以展示其可能的作用靶點和通路，為進一步針對性的研究提供依據(jù)和思路。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學對培土清心方進行全面分析，是明確其作用機制的必經(jīng)之路。

1 材料與方法

1.1 特應(yīng)性皮炎GEO芯片獲取與熱圖、火山圖的繪制

利用GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)，搜索“atopic dermatitis”，物種限制為人，下載基因矩陣與平臺數(shù)據(jù)文件，運用“geoPharm04. ann.pl”腳本，將下載的探針轉(zhuǎn)化對應(yīng)的基因名稱。運用R軟件引用“l(fā)imma”包，獲取上調(diào)和下調(diào)的差異基因，保存到于excel中。引用”pheatmap”包，獲取上調(diào)或下調(diào)最顯著的前20個基因，繪制熱圖與火山圖。

1.2 培土清心方活性成分篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，限定物種為人，分別檢索連翹、太子參、燈芯草、山藥、薏苡仁、茯苓、鉤藤、甘草。生物利用度(Oral bioavailability,OB)指藥物被人體吸收速度與程度，口服生物利用度(OB)≥30%，表明藥物有較好的口服生物利用度。類藥性(drug-likeness,DL)是化合物與已知藥物之間的相似性。類藥性(DL)≥0.18，表明化合物有較好化學穩(wěn)定性及溶解度。利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，分別以淡竹葉，牡蠣為檢索詞，設(shè)置“score cutoff≥20”，”校正后P值<0.05”，獲取具有統(tǒng)計學意義的有效活性成分和基因。

1.3 培土清心方有效成分及基因注釋

利用Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)，分別獲取培土清心方活性成分對應(yīng)的基因，保存為“targetName.txt”。運用Perl腳本和Uniprot數(shù)據(jù)庫，獲取”targetName.txt”中培土清心方基因全稱所對應(yīng)的基因縮寫，命名為“targetsymbol”。

1.4 培土清心方-特應(yīng)性皮炎-分子基因網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將“1.2”中培土清心方藥物活性成分和“1.3”獲得的基因，與“1.1”中特應(yīng)性皮炎差異基因相互映射，將數(shù)據(jù)保存為“txt”格式，導入cytoscape3.7.2軟件，繪制培土清心方-特應(yīng)性皮炎的分子基因網(wǎng)絡(luò)，獲取重要的活性分子與疾病基因。

1.5 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎拓撲網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用“1.4”中映射后的疾病差異基因，導入cytoscape3.7.2，運用Bisogenet及CytoNCA，設(shè)置度中心性(DC)>61，中介中心性(BC)>600。一個節(jié)點DC值越大，該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。BC指一個節(jié)點擔任其他2個節(jié)點之間最短路的橋梁的次數(shù)，BC值越大，說明該節(jié)點愈重要。

1.6 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎的GO功能與KEGG通路富集分析

通過R軟件，從GO、KEGG數(shù)據(jù)庫中獲取培土清心方-特應(yīng)性皮炎每個基因所對應(yīng)的功能，設(shè)置篩選條件為pvalueCutoff<0.05和qvalueCutoff<0.05，并計算每個功能上的基因富集數(shù)，最后將排名前20的GO生物過程和KEGG通路，繪制成柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 特應(yīng)性皮炎GEO芯片獲取與熱圖、火山圖的繪制

從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE63741芯片與平臺數(shù)據(jù)，共50個樣本。圖1熱圖中標簽中藍色C代表正常組，粉色T代表實驗組。基因上調(diào)程度越高，顏色越紅。基因下調(diào)程度越低，顏色越綠，黑色代表中間表達的基因。圖2火山圖中，每個點代表基因，黑色是表達在正常組與實驗組中沒有差異的基因，綠色點代表在正常組下調(diào)的基因，紅色點代表在實驗組上調(diào)的基因。

圖1 正常組與特應(yīng)性皮炎患者差異基因熱圖Figure 1 Heat map of differential genes between normal control group and atopic dermatitis patients

圖2 正常組與特應(yīng)性皮炎患者差異基因火山圖Figure 2 Volcano map of differential genes between normal control group and atopic dermatitis patients

2.2 培土清心方-特應(yīng)性皮炎-分子基因網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

與特應(yīng)性皮炎相關(guān)的中藥活性成分共143個，其中燈芯草活性成分7個，茯苓8個，甘草72個，鉤藤27個，連翹9個，山藥7個，太子參4個，薏苡仁4個，淡竹葉3個，牡蠣2個。

培土清心方-特應(yīng)性皮炎-分子基因網(wǎng)絡(luò)圖中(見圖3)，大多數(shù)藥物分子作用于多個疾病基因。對應(yīng)疾病基因最多的前3個分子分別是MOL000098、MOL000006、MOL000449,其代表的活性分別為槲皮素、豆甾醇和木犀草素。特應(yīng)性皮炎的基因中，PPARG對應(yīng)多個藥物分子。

圖3 培土清心方-特應(yīng)性皮炎-分子基因網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PTQX formula-atopic dermatitis-molecular gene network

2.3 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎基因的拓撲網(wǎng)絡(luò)圖

設(shè)置BC>600，共得到12個核心基因，如圖4C，并按BC值大小進行排序，BC數(shù)值越大，表明基因在該網(wǎng)絡(luò)中越重要。BC值排名前二的基因為TP53和NTRK1，是培土清心方治療特應(yīng)性皮炎的重要候選靶標。

圖4 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎基因的拓撲網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Topological network of PTQX formula for the treatment of atopic dermatitis

2.4 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎的GO功能與KEGG通路富集分析

圖5 ，BP(biological process),縱坐標代表培土清心方-特應(yīng)性皮炎基因的生物過程，圖6，CC(cell component),縱坐標代表培土清心方-特應(yīng)性皮炎基因的細胞成分。圖7，MF(molecular function)，縱坐標代表培土清心方-特應(yīng)性皮炎基因的分子功能。圖8，KEGG通路圖中，縱坐標代表培土清心方-特應(yīng)性皮炎基因的通路，橫坐標代表富集在該通路的基因個數(shù)。彩色代表P值，P值越小，顏色越紅。

圖5 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎基因生物過程(BP)圖Figure 5 Biological process (BP) of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

圖6 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎基因細胞成分(CC)圖Figure 6 Cellular component (CC) of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

圖7 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎基因分子功能(MF)圖Figure 7 Molecular function (MF) of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

圖8 培土清心方治療特應(yīng)性皮炎的KEGG通路富集分析Figure 8 Enrichment analysis of KEGG pathway of PTQX formula in the treatment of atopic dermatitis

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學聯(lián)合GEO數(shù)據(jù)庫，分析培土清心方治療特應(yīng)性皮炎的分子作用機制，培土清心方-特應(yīng)性皮炎基因網(wǎng)絡(luò)圖，可以看出槲皮素、豆甾醇和木犀草素對應(yīng)多個疾病基因，因此它們很可能是培土清心方的多效活性化合物，培土清心方君藥為連翹和太子參，其中槲皮素是連翹有效活性成分，豆甾醇為太子參有效活性成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗衰老、抗癌等藥理作用，能夠調(diào)節(jié)白細胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)x、組胺、肥大細胞中類胰蛋白酶的釋放[6]，從而對AD具有治療作用。 豆甾醇是一種具有確定的免疫調(diào)節(jié)特性的天然甾醇，Antwi AO[7]等研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇具有控制炎癥的特性，使小鼠耳部皮膚水腫和中性粒細胞減少，并且還可降低局部應(yīng)用TPA誘導的TNFα的血清水平。豆甾醇可顯著降低小鼠耳朵皮膚組織的表皮層增厚和炎性細胞浸潤。薏苡仁作為培土清心方臣藥，其含有有效成分木犀草素。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抑菌、免疫調(diào)節(jié)的作用。王倩等[8]發(fā)現(xiàn)木犀草素主要是通過抑制DNA拓撲異構(gòu)酶的活性，進而影響菌體核酸及蛋白質(zhì)的合成，從而抑制金黃色葡萄球菌活性。而金黃色葡萄球菌通常定植在AD患者皮膚上，導致疾病發(fā)展和惡化[9]。故木犀草素可能通過抑制金黃色葡萄球菌，對AD產(chǎn)生治療作用。

特應(yīng)性皮炎的基因中，PPARG對應(yīng)多個藥物分子，是培土清心方發(fā)揮治療作用的重要靶標。PPARG也被稱為PPARγ，為過氧化物酶體增殖物激活的受體γ。近年來，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ的抗炎作用已得到廣泛研究。PPAR-γ激動劑作為單核細胞和巨噬細胞的負調(diào)節(jié)因子，并且劑量依賴性地抑制人單核細胞中炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生[10-11]。培土清心方可能通過PPARG受體，發(fā)揮對AD的抗炎作用。

GO富集分析主要涉及response to steroid hormone生物過程、nuclear receptor activity分子功能、condensed chromosome細胞過程。response to steroid hormones是對類固醇激素反應(yīng)的生物過程，糖皮質(zhì)激素因其特殊的抗炎、抗增生、免疫抑制和血管收縮作用，而被用于治療AD的一線藥物[12]。雌激素與膠原蛋白合成、皮膚厚度和皮膚含水量增加(通過透明質(zhì)酸的產(chǎn)生)以及屏障功能和傷口愈合的改善有關(guān)[13]。這與AD發(fā)病密切相關(guān)，皮膚屏障破壞會使經(jīng)皮水分丟失量(TEWL)增加，攝取過敏原增多，從而促發(fā)過敏反應(yīng)和加重 AD 的炎癥反應(yīng)[14]。nuclear receptor activity代表核受體活性，核受體是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，培土清心方富集在該分子功能上基因有PGR、AR、PPARG、SREBF1。PGR為孕激素受體，在排卵期，雌激素和孕酮的水平升高會抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)，而這兩種激素的水平較低都與斑貼試驗反應(yīng)性增強有關(guān)，從而導致AD患者的病情加重[15]。雌激素、孕酮可能會抑制細胞免疫[16]。故培土清心方可能通過調(diào)節(jié)對類固醇激素反應(yīng)，核受體活性，參與對細胞免疫的調(diào)控。

KEGG分析顯示，培土清心方可能通過影響AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路)來實現(xiàn)對AD的調(diào)控。富集于該通路基因為BAX、CCL2、SELE、F3、PRKCB、SERPINE1。CCL2也被稱作MCP-1，該趨化因子是CC亞家族的成員，是涉及免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程的分泌蛋白超家族。MCP-1表達水平在個體之間高度可變，可能會導致對各種炎癥狀況的差異敏感性[17]。劉文靜[2]亦研究培土清心法對CC亞家族趨化因子的影響，實驗結(jié)果表明該中藥可能通過降低CC亞家族血清中的MDC、CTACK水平而起治療作用。

綜上，培土清心方治療特應(yīng)性皮炎是通過多成分、多基因、多通路發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)細胞免疫、抑菌的作用，這將為進一步深入研究此方作用機制提供參考。也為培土清心方治療AD的基礎(chǔ)、臨床研究及新藥研制提供一定的理論依據(jù)。