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超聲對(duì)小麥蛋白水解物美拉德反應(yīng)進(jìn)程的影響

2020-08-28 07:22:56
食品研究與開發(fā) 2020年17期
關(guān)鍵詞:拉德接枝水解

(湖北大學(xué)知行學(xué)院,湖北武漢 430011)

小麥?zhǔn)俏鞣斤嬍持谐R姷墓任铮堑鞍踪|(zhì)的重要來源。近年來,小麥蛋白水解后生成的一些功能性多肽,如色氨酸、酪氨酸等,具有良好的抗氧化性、抑菌性、乳化性等功能特性[1-2]。但小麥蛋白水解相關(guān)產(chǎn)物存在一些問題,產(chǎn)物的抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于合成抗氧化劑的抗氧化能力。因此,需要尋求一種有效安全的方法提高蛋白質(zhì)的功能特性。大量研究發(fā)現(xiàn),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物如類黑素、中間物質(zhì)、還原酮,具有良好的抗氧化效果。然而,KIM等認(rèn)為美拉德反應(yīng)易受到內(nèi)部因素(如pH值、溫度、時(shí)間等)以及外部環(huán)境因素(如微波、超聲等)的影響[3]。環(huán)境因素對(duì)美拉德反應(yīng)進(jìn)程中產(chǎn)物形成的影響已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注。

現(xiàn)階段,關(guān)于超聲的研究已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注,超聲波可以改善各種食品的化學(xué)、物理和功能特性。超聲被定義為頻率大于20 kHz的一種安全且環(huán)保的高頻聲波。超聲波目前被認(rèn)為是研究和評(píng)估這些生物分子行為的有用工具,其中超聲技術(shù)可以改善蛋白質(zhì)功能性。值得注意的是,超聲波在改善美拉德反應(yīng)產(chǎn)物功能性質(zhì)方面有許多報(bào)道。STANIC等研究發(fā)現(xiàn),超聲作用對(duì)蛋白質(zhì)與不同種類多糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有一定的促進(jìn)作用[4],能增強(qiáng)產(chǎn)物的抗氧化作用,但目前的研究主要集中在超聲作用對(duì)于蛋白質(zhì)美拉德反應(yīng)過程的影響,而關(guān)于超聲對(duì)蛋白質(zhì)水解物美拉德反應(yīng)的研究還未見報(bào)道。本文以小麥蛋白水解物為原料,研究超聲對(duì)小麥蛋白水解物美拉德反應(yīng)進(jìn)程影響,測(cè)定美拉德反應(yīng)褐變程度、中間產(chǎn)物變化、接枝度、產(chǎn)物熒光強(qiáng)度、內(nèi)源性熒光強(qiáng)度以及紫外吸收光譜等指標(biāo),以期為開發(fā)食品中天然抗氧化劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥蛋白(蛋白質(zhì)含量≥75%):廣州千勝精細(xì)化工有限公司;葡萄糖:安徽生物科技有限公司;堿性蛋白酶(100 000 U/g~200 000 U/g):美國 Sigma公司;甲醇、硼砂、β-巰基乙醇、鄰苯二甲醛、8-苯胺-1-萘磺酸(均為分析純):上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD500-2型電子天平:上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司;GL-21M型冷凍離心機(jī):上海赫田科學(xué)儀器有限公司;UT-1800型紫外可見光分光光度計(jì):北京華旭世紀(jì)科技有限公司;DK-8B型電熱恒溫水浴鍋:上海浦予工業(yè)科技有限公司;JY-92-ⅡN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī):寧波新芝生物科技股份有限公司;JB-2型恒溫磁力攪拌器:常州榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥蛋白水解物的制備

稱量一定質(zhì)量的小麥蛋白粉,配制成60 mg/mL的小麥蛋白溶液,磁力攪拌4 h。加入堿性蛋白酶(酶與底物濃度質(zhì)量比為1∶50),45℃水浴水解2 h,緩慢加入1 mol/L的NaOH溶液保持pH值約為8.0。然后于95℃水中加熱10 min,冰浴冷卻使其達(dá)到25℃,最后用1 mol/L的HCl調(diào)pH值至7.0。將得到的水解物進(jìn)行冷凍干燥得到凍干粉,使用雙縮脲方法測(cè)定蛋白水解物的含量,以便后期試驗(yàn)使用。

1.3.2 小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物

將小麥蛋白水解物配制成30 mg/mL的溶液,與30 mg/mL葡萄糖溶液按照1∶1的質(zhì)量比進(jìn)行混合,磁力攪拌使其完全溶解,調(diào)節(jié)混合溶液的pH值至8.0,于95℃水浴鍋加熱180 min,超聲功率為300 W,時(shí)間為 0、20、40、60、80 min,冷卻至 25℃。

1.3.3 中間產(chǎn)物以及褐變程度分析

將樣品調(diào)至蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL,分別在294 nm和420 nm處測(cè)量其吸光值。

1.3.4 接枝度測(cè)定

參照KIM等的方法并略作改動(dòng)[5]。將樣品用去離子水稀釋至蛋白濃度為2 mg/mL,取200 μL樣品于10 mL離心管中,加入4 mL的鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)溶液,充分混勻,于35℃水浴加熱2min,冷卻至25℃,340 nm處測(cè)其吸光值。

1.3.5 表面疏水性測(cè)定

將樣品稀釋成蛋白質(zhì)濃度分別為1.00、0.75、0.5、0.25 mg/mL,將2 mL樣品與10 μL的8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)溶液混勻,在370 nm激發(fā)波長下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.3.6 熒光光譜分析

參照LI等的方法并略作調(diào)整[6]。將樣品稀釋成蛋白濃度為1 mg/mL。反應(yīng)產(chǎn)物的激發(fā)波長為347 nm,掃描范圍為370 nm~550 nm;內(nèi)源性熒光光譜的激發(fā)波長為280 nm,掃描范圍為300 nm~400 nm,狹縫寬度為5 nm。

1.3.7 紫外光譜分析

將樣品稀釋至蛋白質(zhì)濃度為1 mg/mL。紫外掃描光譜范圍200 nm~350 nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進(jìn)行,差異顯著性(P<0.05)分析使用Tukey HSD程序,采用Sigmaplot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐變程度變化

超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)褐變程度、中間產(chǎn)物以及接枝度的影響見表1。

表1 超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)褐變程度、中間產(chǎn)物以及接枝度的影響Table 1 Effects of ultrasonic time on browning degree,intermediate product and graft degree of wheat proteolytic protein in Maillard reaction

小麥蛋白水解物和多糖加熱條件下發(fā)生美拉德反應(yīng),但美拉德反應(yīng)過程經(jīng)常出現(xiàn)褐變,這可能是由于美拉德反應(yīng)的高級(jí)階段形成一種棕色的物質(zhì),稱為類黑精。根據(jù)這些物質(zhì)在420 nm的吸光值來確定其褐變程度。由表1可知,隨著超聲時(shí)間的增加,褐變程度呈現(xiàn)先逐漸升高后逐漸降低的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí),褐變程度最大。表明超聲作用破壞多肽的三級(jí)以及四級(jí)結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生更多的游離氨基酸。李曉東等研究發(fā)現(xiàn)類黑精含有短鏈氨基酸序列,具有良好的抗氧化效果[7]。隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長,可能超聲作用造成蛋白水解物的結(jié)構(gòu)過度伸展,使得多肽的活性降低,因此不利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。

2.2 中間產(chǎn)物和接枝度變化

美拉德反應(yīng)過程中,糖類物質(zhì)會(huì)裂解產(chǎn)生一些無色的酮類及醛類小分子,我們可以根據(jù)294 nm下的吸光值判斷其中間產(chǎn)物的多少。由表1可知,隨著超聲時(shí)間的增加,294 nm處的吸光值出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(P<0.05)。隨著超聲時(shí)間的增加,多肽結(jié)構(gòu)完全被打開,內(nèi)部固有的氨基基團(tuán)被暴露。美拉德反應(yīng)過程中游離氨基的數(shù)量通過計(jì)算可以得到接枝度,因此接枝度可以用來反映美拉德反應(yīng)的程度。由表1可以看到,隨著超聲時(shí)間的延長,接枝度顯著增加,超聲時(shí)間為40 min時(shí),接枝度達(dá)到最大值,為16.8%(P<0.05)。BYCKOW等研究發(fā)現(xiàn)超聲作用可能導(dǎo)致小麥蛋白水解物內(nèi)部更多的親水性氨基酸游離出來,同時(shí)超聲可以引起局部相對(duì)平移運(yùn)動(dòng)可能使得反應(yīng)基團(tuán)相互靠近,因此導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解物的氨基與多糖的糖基共價(jià)交聯(lián),增加美拉德反應(yīng)速度[8]。超聲時(shí)間過長導(dǎo)致小分子肽的聚集,并且此結(jié)果與褐變程度以及中間產(chǎn)物結(jié)果一致。

2.3 表面疏水性分析

超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)表面疏水性的影響如圖1所示。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)表面疏水性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the surface hydrophobicity of wheat protein hydrolysates in Maillard reaction

經(jīng)過超聲處理后,樣品的表面疏水性增加,這與前面內(nèi)源性熒光光譜的結(jié)果一致。隨著超聲時(shí)間的增加,由于超聲具有一定的空穴作用,暴露更多的疏水性氨基酸殘基,因而導(dǎo)致表面疏水性的增加。但是超聲時(shí)間過長導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子電荷重新分布,內(nèi)部的氨基酸殘基發(fā)生聚集折疊現(xiàn)象導(dǎo)致疏水性氨基酸無法暴露出來,隱藏在分子內(nèi)部。

2.4 熒光光譜分析

超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光光譜的影響如圖2所示。

由圖2(A)可知,超聲前期,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì),超聲時(shí)間為40 min時(shí),熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。這可能是由于多肽表面部分氨基酸殘基暴露,并且在美拉德反應(yīng)過程中移向更加親水的微環(huán)境。然而,當(dāng)超聲時(shí)間超過40 min,熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),這歸因于與多肽結(jié)合的多糖鏈的屏蔽效應(yīng)。此外,最大的熒光發(fā)射波長處于420 nm~440 nm范圍內(nèi),這與美拉德發(fā)光熒光體的特征波長一致。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光光譜的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on fluorescence spectra of Maillard reaction products of wheat proteolytic products

內(nèi)源性熒光光譜可以用來反映芳香族氨基酸(主要是色氨酸和酪氨酸)熒光強(qiáng)度的變化,從而間接反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,進(jìn)而反映美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度。由圖2(B)可知,與為超聲的樣品相比,超聲顯著降低了內(nèi)源性熒光光譜的強(qiáng)度。隨著時(shí)間的增加,熒光光譜逐漸升高,在40 min時(shí)達(dá)到最大值,然后逐漸降低。說明超聲時(shí)間導(dǎo)致蛋白水解物的構(gòu)象發(fā)生一定的變化,芳香族氨基酸暴露在更加親水的環(huán)境中,特征吸收峰改變,引起熒光淬滅。然而,過度的超聲時(shí)間處理導(dǎo)致多肽發(fā)生去折疊現(xiàn)象,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加。

2.5 紫外吸收光譜分析

超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)紫外光譜的影響如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)小麥蛋白水解物的美拉德反應(yīng)紫外光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on ultraviolet absorption spectrum of Maillard reaction of wheat protein hydrolysate

隨著超聲時(shí)間的增加,紫外吸收值先呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),表明席夫堿的生成量逐漸增加。超聲波使得一些氨基酸殘基如芳香族氨基酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,暴露更多的發(fā)光基團(tuán),導(dǎo)致紫外吸光值的增加。YU等研究發(fā)現(xiàn),一些氨基酸如精氨酸與葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰有兩個(gè),分別是265 nm和215 nm[9]。這與我們的研究結(jié)果不一致,可能有蛋白水解物有關(guān)。

3 結(jié)論

超聲處理可以改善小麥蛋白水解物美拉德反應(yīng)的進(jìn)程,其產(chǎn)物均高于非超聲對(duì)照組。超聲40 min時(shí),美拉德反應(yīng)的褐變程度、中間產(chǎn)物以及接枝度均具有最大值,但是隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步增加,由于蛋白質(zhì)聚集導(dǎo)致其美拉德反應(yīng)速率降低,產(chǎn)物生成量降低。另外,熒光光譜、紫外光譜以及表面疏水性也充分證明其多肽結(jié)構(gòu)的變化,從而影響美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。因此,控制超聲時(shí)間在40 min內(nèi),可提高美拉德反應(yīng)的速率,進(jìn)而提高其功能特性。

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