張玉超，劉旭東

（1.茅臺學(xué)院釀酒工程系，貴州仁懷564507；2.茅臺學(xué)院食品科學(xué)與工程系，貴州仁懷564507）

作為生產(chǎn)聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂的重要原料，雙酚A（bisphenol A，BPA）的使用量逐年升高[1-2]。隨著這些材料的廣泛使用，特別是在食品行業(yè)中的使用，BPA遷移后可通過生物鏈進(jìn)入生物體。作為一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，BPA可通過干擾內(nèi)分泌功能對生物體產(chǎn)生生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、致癌性等多種毒性作用[3-5]。因此，BPA殘留量的檢測對于控制BPA的環(huán)境暴露量，保護(hù)人類健康和生態(tài)環(huán)境有重要意義。

目前國內(nèi)外對于BPA的檢測基本采用儀器分析法，這些檢測方法依賴價格昂貴的檢測設(shè)備，例如高效液相色譜儀、氣相色譜儀、質(zhì)譜儀等，操作和樣品前處理復(fù)雜，且不能同時對大量樣品進(jìn)行檢測[6-7]。酶聯(lián)免疫分析法（enzyme-linked immunoassay，ELISA）依賴高特異性的抗體，利用抗原-抗體特異性反應(yīng)，很好地彌補了儀器分析法的不足[8-9]。本研究以制備BPA單克隆抗體為基礎(chǔ)，構(gòu)建一種BPA的間接競爭ELISA（indirect competitive ELISA，icELISA）檢測方法，為 BPA ELISA檢測技術(shù)發(fā)展提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠：湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心；Sp2/0細(xì)胞：武漢大學(xué)保藏中心。

BPA、雙酚酸（4，4-bis（4-hydroxyphenyl）valeric acid，BVA）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDAC）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）：國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；福氏完全佐劑（Freund′s complete adjuvant，F(xiàn)CA）、福氏不完全佐劑（Freund′s incomplete adjuvant，F(xiàn)ICA）：Sigma-Aldrich公司。以上試劑均為分析純。

包被緩沖液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH7.4）；抗體稀釋液：含0.1%BSA的PBS；封閉液：3%脫脂奶粉溶液；洗滌液：含0.05%吐溫-20 的 PBS；終止液：2 mol/L H2SO4。

DMEM培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基：Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S-3100型紫外分光光度計：Scinco公司；ELX800型酶標(biāo)儀：Bio-tek公司；5415R型低溫冷凍離心機(jī)：Eppendorf公司；BB15型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱：Thermo公司；TS2-FL型倒置顯微鏡：Nikon公司。

1.3 BPA人工抗原合成

以BVA作為半抗原與BSA、OVA分別進(jìn)行偶聯(lián)，制備完全抗原BVA-BSA、BVA-OVA。在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[10]，取 0.9 mg BVA、2.98 mg NHS、4.56 mg EDAC溶于 300 μL DMF 中，17 ℃，130 r/min，避光反應(yīng) 16 h，得到溶液A。將12 mg BSA和12 mg OVA分別溶于2 mL pH9的PBS中，得到溶液B。將溶液A逐滴加入溶液B中，攪拌均勻后25℃左右下避光反應(yīng)12 h，得到溶液C。將溶液C在6 000 r/min離心5 min，取上清液裝入透析袋置于pH7.4，0.01mol/L的PBS中，4℃透析至少48 h，每隔12 h換液1次。對所得的人工抗原進(jìn)行紫外掃描確定偶聯(lián)是否成功，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫BALB/c小鼠

對BALB/c小鼠進(jìn)行頸背部皮下多點人工抗原免疫（BVA-BSA 或 BVA-OVA 100 μg溶解于 100 μL pH7.4的PBS中，與等體積的FCA或FICA混合），按表1的免疫方案進(jìn)行免疫[11]。

表1 免疫方案Table 1 The immunization protocol

1.5 抗血清效價和靈敏度的測定

第4次免疫7 d后，對免疫的小鼠進(jìn)行斷尾取血，對抗血清的效價和靈敏度分別采用間接ELISA（indi rect noncompetitive ELISA，inELISA）和間接競爭ELISA（indirect competitive ELISA，icELISA）進(jìn)行測定[12]。免疫原為BVA-OVA的小鼠抗血清進(jìn)行ELISA測定時使用1.0 mg/mL BVA-BSA作為包被原，免疫原為BVABSA的小鼠抗血清使用1.0 mg/mL BVA-OVA作為包被原。選擇抗血清效價和靈敏度都很高的小鼠作為細(xì)胞融合中脾細(xì)胞的供體。

1.6 單克隆抗體的制備和純化

在細(xì)胞融合前3 d，對小鼠進(jìn)行200 μg免疫原腹腔注射（加強免疫），取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，記錄有融合細(xì)胞的孔，待細(xì)胞克隆長至板底約1/10時，用icELISA對細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測，選取特異性最好的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋。將HAT培養(yǎng)基換成HT培養(yǎng)基，陽性細(xì)胞至少進(jìn)行3次克隆化，使得陽性率達(dá)到100%后換DMEM培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)建立細(xì)胞株。取10周齡BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，10 d后腹腔注射狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞株（1×106個～2×106個），10 d后無菌操作收集小鼠腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化[12]。

1.7 包被抗原濃度和抗體稀釋比的確定

將包被原稀釋至 1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，4 ℃包被過夜，將BPA單克隆抗體按照1∶8 000、1∶16 000、1 ∶32 000、1 ∶64 000、1 ∶128 000、1 ∶256 000、1 ∶512 000的體積比進(jìn)行倍比稀釋，進(jìn)行方陣滴定[13]。選取OD450值大約為1的組合進(jìn)行icELISA測定，選擇IC50值最小的組合作為最佳包被抗原濃度和抗體稀釋比組合。

1.8 間接競爭ELISA法條件優(yōu)化

在最佳包被抗原濃度和抗體稀釋比下對反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑的種類及含量、pH值、溫度、封閉劑進(jìn)行優(yōu)化。分別使用5%、10%、15%、20%、25%的DMSO、DMF、甲醇、乙腈配制BPA標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行icELISA，計算各反應(yīng)條件下的IC50，選取IC50值最小的條件進(jìn)行后續(xù)條件的優(yōu)化。采用同樣的方法對競爭反應(yīng)體系pH值（6.4、7.4、8.4、9.4）、反應(yīng)溫度（4、25、30、37 ℃）、封閉劑（1%BSA、1%OVA、1%明膠、3%脫脂奶粉）進(jìn)行優(yōu)化，選擇IC50最小的條件作為BPA檢測icELISA法的最優(yōu)條件。

1.9 BPA檢測間接競爭ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)所建立的icELISA檢測方法，采用不同濃度的 BPA 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、200 ng/mL）與BPA單克隆抗體競爭，以抑制率為縱坐標(biāo)，Lg（10×CBPA）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算IC50。

1.10 交叉反應(yīng)率的測定

采用1.9所述方法，將BPA標(biāo)準(zhǔn)液換成BPA類似物雙酚S、BVA、對苯二酚、鄰羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行IC50的測定，計算交叉反應(yīng)率CR，CR/%=BPA的IC50/BPA 類似物 IC50×100。

1.11 加標(biāo)回收率的測定

利用去離子水將BPA配制成濃度為2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的加標(biāo)水樣，采用icELISA法測定水樣中BPA含量，計算加標(biāo)回收率/%=實際測得的BPA濃度/BPA標(biāo)準(zhǔn)濃度×100。

1.12 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn)；以GraphPad Prism 5.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPA人工抗原的合成

BVA與BSA和OVA通過活性酯法偶聯(lián)后，BVA、BSA、OVA、BVA-OVA和BVA-BSA的紫外掃描結(jié)果如圖1、2所示。

圖1 BVA、OVA、BVA-OVA紫外掃描圖Fig.1 Ultraviolet absorbance spectra of BVA，OVA，BVA-OVA

圖2 BVA、BSA、BVA-BSA紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet absorbance spectra of BVA，BSA，BVA-BSA

結(jié)果顯示BVA在220 nm～290 nm范圍內(nèi)有強吸收峰，在275nm處出現(xiàn)了最高吸收峰；OVA在215nm和270 nm處有最強吸收峰；BVA-OVA在220 nm～300 nm范圍內(nèi)有強吸收峰，在290 nm附近有最強吸收峰，BVA-OVA體現(xiàn)了BVA和OVA的吸收特征，且最大吸收峰波長出現(xiàn)了一定的紅移，又顯示出自身的特性，因此可以判斷BVA和OVA偶聯(lián)成功。BVA和BSA偶聯(lián)情況和上述類似，可以判斷BVA和BSA偶聯(lián)成功。

2.2 抗血清效價和靈敏度的測定

免疫周期完成以后，對各免疫小鼠抗血清的效價和靈敏度進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。

結(jié)果顯示，BVA-BSA作為免疫原顯示出了比較高的靈敏度（IC50低），但是總體效價偏低，而BVA-OVA作為免疫原，特別2號小鼠產(chǎn)生的抗血清具有高效價（>256 000）和高靈敏度（IC50＜221 ng/mL）。所以2號小鼠選擇作為脾細(xì)胞供體制備雜交瘤細(xì)胞。

表2 抗血清效價和靈敏度Table 2 Titers and sensitivity of antisera

2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

雜交瘤細(xì)胞的篩選結(jié)果見表3。

經(jīng)細(xì)胞融合，篩選到6株陽性細(xì)胞株，其中3A11細(xì)胞株隨BPA競爭濃度的增加OD450顯色程度下降明顯，說明其可分泌對BPA親和力較高的單克隆抗體。此細(xì)胞株被選擇用于采集腹水，收集到的腹水采用辛酸-硫酸銨法純化。

表3 雜交瘤細(xì)胞的篩選Table 3 Screening of hybridoma cells

2.4 icELISA法的建立

方陣滴定的結(jié)果顯示，在包被抗原的質(zhì)量濃度和抗體稀釋倍數(shù)為 1 μg/mL、256 000，0.5 μg/mL、128 000，0.25 μg/mL、64 000，0.25 μg/mL、32 000，0.125 μg/mL、32 000時OD450值大約為1。對以上幾種組合的靈敏度進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 最適包被抗原質(zhì)量濃度和單克隆抗體稀釋倍數(shù)組合的IC50值Table 4 IC50for screening of optimal coating concentration and diluted multiples of monoclonal antibody

表4的結(jié)果顯示，包被抗原的質(zhì)量濃度為1μg/mL，抗體稀釋倍數(shù)為256 000時IC50最低，且抗體稀釋度最大，因此選擇此組合作為最適包被抗原質(zhì)量濃度和抗體稀釋倍數(shù)組合。

競爭反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑的種類和濃度、競爭反應(yīng)體系pH值、競爭反應(yīng)體系溫度以及封閉劑的種類對icELISA的影響如圖3～6所示。

圖3 有機(jī)溶劑對icELISA的影響Fig.3 Influence of organic solvents on icELISA

圖4 pH值對icELISA的影響Fig.4 Influence of pH on icELISA

圖5 反應(yīng)溫度對icELISA的影響Fig.5 Influence of temperature on icELISA

圖6 封閉劑對icELISA的影響Fig.6 Influence of blocking agents on icELISA

結(jié)果顯示，反應(yīng)體系中添加15%的DMSO，體系pH值為7.4，溫度為25℃，并采用1%OVA作為封閉劑icELISA的靈敏度最高。因此優(yōu)化的icELISA反應(yīng)條件為：以1 μg/mL的BVA-BSA為包被抗原，BPA單克隆抗體稀釋倍數(shù)為256 000倍，競爭反應(yīng)體系添加15%的DMSO，pH7.4，25℃，以1%OVA作為封閉劑。

2.5 BPA icELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

按照icELISA的檢測條件，利用BPA不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。

圖7 BPA icELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curves of BPA by icELISA

標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.5 ng/mL～50 ng/mL范圍內(nèi)顯示出了良好的線性關(guān)系，IC50值為16.65 ng/mL，檢測下限IC10為0.5 ng/mL。

2.6 交叉反應(yīng)率測定

利用本研究所得的單克隆抗體與BVA、雙酚S、對苯二酚和鄰羥基苯甲酸進(jìn)行icELISA，計算IC50，結(jié)果如表5所示。結(jié)果顯示4種BPA類似物的交叉反應(yīng)率均非常小，說明本研究所得到的BPA單克隆抗體特異性好。

表5 交叉反應(yīng)率Table 5 Cross-reactivity of the assay

2.7 水樣中加標(biāo)回收率測定

水樣中加標(biāo)回收率的結(jié)果如表6所示，結(jié)果顯示BPA的加標(biāo)回收率為89.72%～105.25%。

表6 水樣中BPA加標(biāo)回收率Table 6 Recovery rate of BPA in water

3 結(jié)論與討論

BPA在人類生活中有著廣泛的應(yīng)用，由于可以遷移到食品和周圍環(huán)境中，且具有多種毒性，特別是內(nèi)分泌干擾作用，對人和動物的健康具有嚴(yán)重危害。目前BPA儀器分析法存在很多的不足，而ELISA檢測法很好地彌補了儀器分析法的不足。

由于BPA屬于小分子化合物，只具有反應(yīng)原性無免疫原性，所以需要合成大分子的人工抗原進(jìn)行免疫。本研究選用BPA結(jié)構(gòu)類似物BVA作為半抗原，引入了3個直鏈碳原子連接臂和羧基，通過碳化二亞胺法將BVA與BSA、OVA偶聯(lián)，合成人工抗原BVABSA和BVA-OVA。以往的研究認(rèn)為BSA由于具有很多優(yōu)點，是制備人工抗原的首選蛋白載體[14]。而在本研究中，BVA-BSA免疫的所有小鼠抗血清對于BPA有著較好的特異性，但是效價很低；而BVA-OVA免疫的小鼠中則出現(xiàn)了特異性和效價都很高的個體，而在后期的icELISA方法構(gòu)建中，選擇BVA-BSA作為包被原體現(xiàn)出了很好的靈敏度。說明選擇以何種蛋白質(zhì)作為載體蛋白需要通過最終的免疫效果來確定。

傳統(tǒng)的制備抗體的免疫方案是在第一次免疫時將抗原與等體積的FCA混勻注射，隨后每2～4周換用抗原與等體積的FICA混勻注射進(jìn)行加強免疫[15-16]，此種方法獲得高效價的抗體周期長，一般需要3個月左右。本研究依據(jù)前期研究，在第3天重復(fù)第1次免疫，在第28天換用FICA進(jìn)行免疫，在第49天再進(jìn)行加強免疫，采用4次免疫篩選出血清效價和特異性較高的小鼠，縮短了免疫周期。并采用聚乙二醇法進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過3次篩選，成功獲得一株分泌抗BPA單克隆抗體的細(xì)胞株。

ELISA反應(yīng)受多種因素影響，在建立ELISA檢測方法前需要對反應(yīng)體系的包被抗原濃度和抗體工作濃度、有機(jī)溶劑種類和含量、反應(yīng)溫度、pH值、封閉劑種類等條件進(jìn)行優(yōu)化[17-20]，從而提高檢測的靈敏度。本研究中以IC50作為不同條件下icELISA的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確立了基于BPA單克隆抗體的icELISA方法，該檢測方法檢測下限IC10為0.5 ng/mL，IC50值為16.65 ng/mL，水樣中加標(biāo)回收率為89.72%～105.25%。

本研究構(gòu)建了基于BPA單克隆抗體的icELISA檢測方法，該方法與傳統(tǒng)的儀器分析法相比具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點，可用于BPA殘留量的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。