程麗莉，程運河，蘭彥平，曹慶昌，胡廣隆，蘇淑釵

(1.北京林業(yè)大學省部共建森林培育學科與保護重點試驗室，北京 100083；2.北京市林業(yè)果樹科學研究院，北京 100093)

【研究意義】板栗為殼斗科(Fagacaea)栗屬(Castanea)落葉果樹，起源與我國，栽培歷史悠久，是我國重要的經(jīng)濟樹種。板栗種仁含有大量人體有益的次生代謝物質(zhì)，如胡蘿卜素、沒食子酸、原兒茶酸等，其營養(yǎng)保健功效又重新被人們重視。但在加工環(huán)節(jié)中，這些次生物質(zhì)伴隨栗仁褐變問題發(fā)生，嚴重影響其產(chǎn)品的感官質(zhì)量和營養(yǎng)價值。【前人研究進展】研究發(fā)現(xiàn)褐變與PPO之間的密切關(guān)系，國內(nèi)外許多學者都圍繞該酶在基因工程技術(shù)方面開展系列研究，試圖通過修飾植株中的褐變相關(guān)酶類基因表達[1-2]，為控制酶促褐變提供可行途徑。PPO是由核基因編碼的銅結(jié)合蛋白酶[3]，表現(xiàn)多基因家族性，在生物體酶促褐變中起到重要的作用，體內(nèi)色素合成的過程中起關(guān)鍵的作用。目前，番茄[4-6]、馬鈴薯[7-8]、甘薯[9]、煙草[10]、香蕉[11]、葡萄[12]、蘋果[13-14]、中國梨[15]、杏[16]、茶樹[17]等植物的PPO基因己被克隆，而板栗鮮見研究?！颈狙芯壳腥朦c】為此，本項研究開辟新途徑從分子水平著手，利用板栗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，預測分析栗仁PPO基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)特性及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為克隆板栗PPO基因提供重要的序列信息，為深入研究果蔬褐變發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 板栗CmPPO基因克隆

取板栗‘YH’品種栗仁組織，立即用液氮冷凍，置于-80 ℃保存，用于RNA提取，植物總RNA提取試劑盒購于Omega公司，利用紫外分光光度計及凝膠電泳檢測質(zhì)量合格。

轉(zhuǎn)錄組測序獲得長1969 bp的Contig序列，經(jīng)Blast分析后發(fā)現(xiàn)其可能編碼多酚氧化酶，根據(jù)該序列設(shè)計引物，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計特異引物，并由上海英俊公司合成。正向引物PPO-1F:5′AACACCTTTACACCAAAACCAC3′，反向引物PPO-1R:5′ GGCAAAAGAAAGAACACAACAAT 3′。以RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，通過PCR同源克隆PPO基因編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系為：2×PCR 反應(yīng)緩沖液12.5 μl，dNTPs 5.0 μl，上下游引物各0.75 μl，cDNA模板1.0 μl，KOD長鏈高保真酶0.5 μl，ddH2O定容值25.0 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，52 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，35個循環(huán)后，72 ℃延伸8 min。PCR結(jié)果凝膠電泳檢測，純化回收，由上海生工測序。

1.2 CmPPO生物信息學分析

核酸及氨基酸序列組成分析、理化性質(zhì)分析、開放閱讀框(open reading frame，ORF)的查找和翻譯，利用軟件及 Prot-Param、p I/Mw、ORF Finder 等在線工具進行；核酸和氨基酸序列的同源性比對及多序列比對利用 Blast 和 Clustal W 在線工具完成；親水性/疏水性的分析利用在線工具ProtScale完成；蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)的預測利用SOPMA[18]和 SWISS MODEL[19]等在線工具完成。MEGA6.0軟件[20]采用Neighborjoining 法(bootstrap值設(shè)定為 1 000)產(chǎn)生系統(tǒng)進化樹。

1.3 不同品種不同組織CmPPO的表達

板栗Real-time PCR內(nèi)參基因引物。擴增體系25 μl：cDNA模板1.0 μl，2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μl，正向引物0.75 μl，反向引物0.75 μl，50×ROX×Reference Dye 0.5 μl，補水ddH2O 9.5 μl。Real-time PCR條件：95 ℃,15 min；95 ℃,15 s，60 ℃,60 s，40個循環(huán)。以安捷倫3005P檢測PPO基因在板栗不同品種、不同組織中的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗果實多酚氧化酶序列的獲得

以反轉(zhuǎn)錄得到的板栗果實cDNA第一鏈為模板，擴增獲得1861 bp的基因序列，通過NCBI的BlastX比對，該片段與多種植物的多酚氧化酶有較高同源性，且片段包含了終止密碼子，開放閱讀框(ORF)長1794 bp，命名為CmPPO。經(jīng)過ORF Finder在線分析，編碼597個氨基酸(圖1)。NCBI Blast p分析板栗PPO氨基酸序列結(jié)果顯示(圖2)，本試驗克隆的基因編碼蛋白屬于絡(luò)氨酸酶基因家族蛋白，具有PPO蛋白典型特征，包含了PPO未知功能的保守結(jié)構(gòu)域(468～594，PPO1_KFDV，pfam12143)、絡(luò)氨酸普通中心區(qū)域(172～380，pfam00264)和多酚氧化酶中間保守域(386～437，pfam12142)。

圖1 CmPPO基因cDNA序列及編碼氨基酸Fig.1 cDNA sequence and amino acid sequence of CmPPO gene

圖2 CmPPO編碼氨基酸保守性分析Fig.2 Amino acids conservation analysis for CmPPO

2.2 板栗PPO基因的生物信息學分析

利用在線軟件ExPASY預測CmPPO編碼蛋白質(zhì)的相對分子量66 335.38，理論等電點(pI)6.45，屬于酸性蛋白總負電荷殘基(Asp+Glu)數(shù)為72，總正電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為67。其半衰期在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細胞為 30 h，在酵母體內(nèi)大于 20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于 10 h。不穩(wěn)定系數(shù)為 40.99>40，為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)77.47，總平均疏水指數(shù)(GRAVY)-0.434，為親水性蛋白(圖3)。板栗CmPPO蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)TMHMM軟件在線分析顯示蛋白全部在膜外(圖4)，不存在跨膜區(qū)，不屬于膜結(jié)合蛋白。

圖3 蛋白親疏水性分析Fig.3 Analysis of hydrophobicity of CmPPO

圖4 板栗CmPPO蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預測Fig.4 Prediction of transmembrane structure of CmPPO

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈氨基酸殘基借助氫鍵折疊和盤繞形成的α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲以及模體等組件，其中，α-螺旋和β-折疊是最常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[21]。無規(guī)則卷曲和α-螺旋是板栗仁PPO蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件，其次是β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。CmPPO二級結(jié)構(gòu)SOPMA預測分析結(jié)果表明，α-螺旋(α-helix，h)的比例最高21.22 %，β-折疊(Beta bridge，b)為0，無規(guī)則卷曲(Random coil，c)59.13 %，延伸主鏈(Extended strand，e)15.91 %，β-轉(zhuǎn)角(Beta turn，t)3.85 %。

應(yīng)用在線三級結(jié)構(gòu)預測軟件Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)，選取其自動建模功能對板栗CmPPO蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)模型進行同源建模分析(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與蘋果絡(luò)氨酸酶結(jié)構(gòu)(MdPPO1)有72.75 %的序列一致度，53 %的序列相似度，從126～597位置的氨基酸84 %相匹配。

圖5 板栗CmPPO蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測Fig.5 Tertiary strcture of CmPPO in chestnuts

2.3 板栗PPO基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

板栗CmPPO基因編碼的氨基酸序列與其他物種PPO基因編碼的氨基酸序列進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)CmPPO氨基酸序列與其他已知的9種植物的PPO氨基酸序列一致性在41.13 %～68.43 %(表1)，其中與薔薇科蘋果PPO氨基酸序列一致性達到68.43 %，與菠菜PPO氨基酸序列的一致性最低，僅為41.13 %。

表1 板栗PPO基因與其他9種植物的PPO基因推導的氨基酸序列相似性比較

為進一步研究不同物種間的PPO蛋白進化關(guān)系，運用MEGA6.0軟件對板栗等17種植物的PPO蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析(圖6)，聚類結(jié)果顯示，板栗CmPPO與核桃先聚在一組，兩者親緣關(guān)系最近，可能具有相似的進化過程和生物學功能；后與龍眼、荔枝、橄欖一組聚在一起；而與山茶、葡萄、杏、番薯、番茄等物種的親緣關(guān)系較遠。

圖6 PPO基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 The phylogenetic tree of PPO gene

2.4 板栗CmPPO基因在不同品種中表達分析

為分析CmPPO基因在板栗不同品種中表達模式，選取褐變度從重到輕的‘YH’、‘YY’和‘YG’3個品種種子胚乳(B)和胚芽(P)進行qRT-PCR。結(jié)果表明，CmPPO基因相對表達量在不同的板栗品種間、果實不同組織器官間存在差異，‘YG’品種不管是在胚乳還是胚芽中表達都是最高，推測可能栗仁PPO基因與其代謝活躍程度、發(fā)育階段、抗逆性等存在密切關(guān)系，而且栗仁褐變也不是單基因控制，而是多基因、多種代謝途徑共同參與作用的復雜結(jié)果，有待后續(xù)試驗驗證。

圖7 PPO基因在板栗不同品種、不同組織中表達分析Fig.7 PPO gene expression level of different varieties and tissues

3 討 論

多酚氧化酶PPO是板栗果實和其他果蔬加工時酶促褐變中酚類和單寧等成分氧化而產(chǎn)生的顏色變化酶源。PPO表現(xiàn)為多基因家族性，而本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序只獲得1個功能注釋的PPO基因序列，則其PPO基因家族是否還存在其他成員，有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。

對于板栗仁為材料獲得的PPO全長序列，本研究利用多種生物信息學方法對其基因序列和編碼蛋白進行預測和分析。保守區(qū)域CmPPO氨基酸序列中，172～380區(qū)域與絡(luò)氨酸普通中心區(qū)域同源，在386～437和468～594區(qū)域分別具有PPO的2個結(jié)構(gòu)域，具有PPO蛋白的典型特征。CmPPO基因編碼的蛋白是非跨膜蛋白，屬于親水性，含有一個與2個銅離子相結(jié)合的中央域絡(luò)氨酸酶等主要功能區(qū)，這與其他物種PPO蛋白特征高度相似[22]。PPO取自完整板栗仁，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量較低，不含β-折疊，而無規(guī)則卷曲含量較高，表明酶活性不高，可能與板栗貯藏時間有關(guān)系。

在同源性分析與同科栓皮櫟(GenBank登錄號 XP_023923556.1)序列PPO一致性高達96.48 %，與薔薇科同樣存在褐變問題的蘋果一致性68.43 %，與藜科草本植物菠菜一致性最低41.13 %。編碼氨基酸序列比對進化樹分析，與胡桃科核桃親緣關(guān)系最近。通過qRT-PCR驗證，CmPPO基因表達豐度存在品種差異，但在不同板栗品種、果實不同組織中表達差異與果實褐變度不一致，在弱褐變品種中表達卻較高，可能是多酚氧化酶是抗性蛋白[23]，參與種子貯藏過程其他代謝活動，表達量受淀粉、糖等代謝影響，由此也說明褐變不是單基因控制，而是多基因、多種代謝途徑共同參與作用的結(jié)果，為在基因水平上研究果蔬褐變機制提供數(shù)據(jù)線索。

4 結(jié) 論

板栗果實多酚氧化酶基因開放閱讀框(ORF)長1794 bp，編碼597個氨基酸，屬于絡(luò)氨酸酶基因家族蛋白，是非跨膜蛋白，屬于親水性，含有一個與2個銅離子相結(jié)合的中央域絡(luò)氨酸酶等主要功能區(qū)，與薔薇科同樣存在褐變問題的蘋果一致性68.43 %，編碼氨基酸序列比對進化樹分析，與胡桃科核桃親緣關(guān)系最近。