李昕 馮瑾 關(guān)興

[摘要] 目的 研究胰腺癌患者血漿中微小RNA（miR）-21及miR-155的表達(dá)及其臨床意義。 方法 選取2017年4月～2019年5月于河北省石家莊市第一醫(yī)院就診的88例胰腺癌患者作為胰腺癌組，50例慢性胰腺炎作為慢性胰腺炎組，50名健康體檢者作為健康對(duì)照組。應(yīng)用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測三組血漿標(biāo)本中miR-21、miR-155的表達(dá)，分析胰腺癌患者血漿miR-21、miR-155的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，受試者工作特征曲線分析血漿miR-21、miR-155及兩者聯(lián)合檢測對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。 結(jié)果 胰腺癌組血清miR-21與miR-155表達(dá)均顯著高于慢性胰腺炎組及健康對(duì)照組（均P < 0.05）。不同腫瘤分化、TNM分期胰腺癌患者血清中miR-21、miR-155的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、病理類型及是否伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者血清中miR-21、miR-155的表達(dá)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。miR-21、miR-155聯(lián)合檢測的診斷價(jià)值高于任一單一指標(biāo)（均P < 0.05）。 結(jié)論 胰腺癌患者血漿miR-21與miR-155表達(dá)升高，且兩者表達(dá)與腫瘤病理分期、病理分級(jí)有關(guān)，聯(lián)合檢測血漿miR-21、miR-155在胰腺癌中具有較高的診斷價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 微小RNA-21;微小RNA-155;胰腺癌;診斷

[中圖分類號(hào)] R735.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）07（b）-0021-04

[Abstract] Objective To study the expression and clinical significance of microRNA （miR）-21 and miR-155 in plasma of patients with pancreatic cancer. Methods A total of 88 patients with pancreatic cancer treated in Shijiazhuang First Hospital from April 2017 to May 2019 were selected as the the pancreatic cancer group， 40 cases of chronic pancreatitis were treated as chronic pancreatitis group， and 40 healthy subjects were treated as healthy control group. Fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the expressions of miR-21 and miR-155 in plasma samples of the three groups， and the relationship between the expressions of miR-21 and miR-155 in plasma and clinicopathological features was analyzed in patients with pancreatic cancer. The subject operating characteristic curve was used to analyze the diagnostic value of plasma miR-21， miR-155 and the combined detection for pancreatic cancer. Results The expressions of serum miR-21 and miR-155 in the pancreatic cancer group were significantly higher than those in the chronic pancreatitis group and the healthy control group （all P < 0.05）. The expressions of miR-21 and miR-155 in the serum of patients with different tumor differentiation and TNM stage pancreatic cancer were statistically significant （all P < 0.05）. There were no statistically significant differences in the expressions of miR-21 and miR-155 in the serum of pancreatic cancer patients with different gender， age， tumor diameter， tumor location， pathological type or whether accompanied by lymph node metastasis （all P > 0.05）. The diagnostic value of combined detection of miR-21 and miR-155 was higher than that of any single indicator （all P < 0.05）. Conclusion The expressions of miR-21 and miR-155 are increased in patients with pancreatic cancer， and their expression is related to tumor pathological stage and pathological grade. Combined detection of plasma miR-21 and miR-155 has a high diagnostic value in pancreatic cancer.

[Keywords] MicroRNA-21; MicroRNA-155; Pancreatic cancer; Diagnosis

胰腺癌是我國癌癥特異死亡的第六大原因，近年來胰腺癌發(fā)病率和死亡率逐漸增加，且預(yù)后較差，晚期腫瘤無法完全切除，5年生存率低于5%[1]。胰腺癌患者早期常無明顯的臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，喪失治療的最佳時(shí)機(jī)，深入研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制并尋找早期診斷的血清標(biāo)志物具有重要的臨床意義。微小RNA（miRNA）是內(nèi)源性的、小的非編碼RNA。miRNA與靶基因信使RNA的特異性序列結(jié)合，改變信使RNA的穩(wěn)定性抑制基因表達(dá)。較多證據(jù)顯示，miRNA參與正常細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)過程[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]等腫瘤中都存在miRNA的升高或降低異常表達(dá)的現(xiàn)象，通過影響下游癌基因的表達(dá)，改變腫瘤增殖、凋亡及浸潤等行為。人類miR-21基因位于染色體17q23.1，研究發(fā)現(xiàn)[5]miR-21可通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Dp家族成員3的表達(dá)，導(dǎo)致復(fù)制起始因子和細(xì)胞周期分裂相關(guān)因子的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂及增殖等。miR-155基因位于人類染色體21q21.3，與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān)。有報(bào)道顯示[6]腫瘤細(xì)胞中miR-155表達(dá)上調(diào)，其可通過降低RhoA等基因信使RNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)下游增殖等細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。但目前miR-21、miR-155在胰腺癌血清中的表達(dá)尚不清楚，本研究通過檢測胰腺癌患者血清中miR-21和miR-155表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，探討兩者在胰腺癌診斷中的診斷價(jià)值。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年4月～2019年5月于河北省石家莊市第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）診斷并治療的88例胰腺癌患者作為胰腺癌組。其中，男51例，女37例;年齡40～72歲，平均（51.23±6.3）歲;腫瘤直徑：≤2 cm者47例，>2 cm者41例;病理類型：腺癌59例，腺鱗癌29例;腫瘤TNM分期[7]：Ⅰ期34例，Ⅱ期39例，Ⅲ期15例;腫瘤分化：高分化20例，中分化33例，低分化35例;腫瘤位置：胰頭部55例，胰體尾部33例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。選取同期于我院就診的慢性胰腺炎患者為慢性胰腺炎組，其中，男28例，女22例;年齡41～71歲，平均（49.15±5.7）歲。另選取同期于我院參加健康體檢者50名為健康對(duì)照組，其中男27名，女23名;年齡40～73歲，平均（48.67±6.2）歲。三組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)檢查，診斷為胰腺癌;②臨床病理和隨訪資料完整;③本研究得到患者及家屬的知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并細(xì)菌性感染、結(jié)核等感染性疾病;②有惡性腫瘤疾病病史;③合并嚴(yán)重的心肝腎等臟器功能不全;④有精神神經(jīng)障礙性疾病;⑤有放化療、免疫治療史。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均知情理解并簽字。

1.2 方法

qRT-PCR檢測血漿miR-21、miR-155的表達(dá)：留取各組清晨空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，4℃下1500 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，將上清血漿移至EP管中，-70℃條件保存。取300 μL血樣，Trizol法提取總RNA，總RNA溶于DEPC水，Narodrop檢測其濃度及純度。以1 μg總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。得到cDNA產(chǎn)物后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系20 μL，含模板cDNA 1 μL，Taq聚合酶0.15 μL、上游及下游引物1 μL、2×SYBR Green mix 10 μL及dNTPs 1 μL，DEPC水7 μL。條件：94℃ 2 min，94℃變性20 s，62℃退火30 s，70℃延伸10 s，共39個(gè)循環(huán)。miR-21的正向引物序列：5′-CGGCGGTTAGC-TTATCAGACTGA-3′，反向引物序列：5′-CCAGTGCA-GGGTCCGAGGTAT-3′，miR-155正向引物序列：5′-CGGCGGTTTAATGCTAATCGTGAT-3′，反向引物序列：5′-CATCACTCCAGGTGAACCCC-3′，內(nèi)參基因U6正向序列：5′-GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT-3′，反向序列：3′-AGCGCAGCGATATCGTCATC-5′。結(jié)果用2-ΔΔCt法表示，miR-21、miR-155的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于內(nèi)參基因U6的比值為2-ΔΔCt，ΔCt=Ct miR-21、miR-155-CtU6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。受試者工作曲線（ROC）分析血漿miR-21、miR-155在胰腺癌中的診斷價(jià)值。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血漿中miR-21、miR-155表達(dá)比較

胰腺癌組血漿中miR-21的相對(duì)表達(dá)量為（3.834±0.932）明顯高于慢性胰腺炎組的（1.128±0.276）及健康對(duì)照組的（0.826±0.203）（t = 17.973、20.155，P = 0.000、0.000）;胰腺癌組血漿中miR-155的相對(duì)表達(dá)量為（5.120±1.312）明顯高于慢性胰腺炎組的（0.427±0.121）及健康對(duì)照組的（0.817±0.241）（t = 22.531、20.543，P = 0.000、0.000）。見圖1。

2.2 胰腺癌患者血漿中miR-21與miR-155表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

不同腫瘤分化、TNM分期胰腺癌患者血清中miR-21、miR-155的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置、病理類型及是否伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者血清中miR-21、miR-155的表達(dá)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。見表1。

2.3 檢測血漿miR-21、miR-155在胰腺癌中的診斷價(jià)值

miR-21、miR-155及聯(lián)合檢測的敏感性分別為78.5%、84.1%、92.2%，特異性分別為84.3%、83.7%、80.2%，準(zhǔn)確度分別為90.5%、93.8%、97.0%，聯(lián)合檢測的敏感性及準(zhǔn)確性高于單一指標(biāo)。繪制miR-21、miR-155的ROC曲線，miR-21、miR-155及兩者聯(lián)合檢測胰腺癌的曲線下面積分別為0.789、0.720及0.868，聯(lián)合檢測miR-21、miR-155診斷的診斷效能明顯大于任一單一指標(biāo)的診斷效能。見圖2。

3 討論

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。胰腺癌解剖位置隱匿，手術(shù)治療難度較大，術(shù)后腫瘤易發(fā)生局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者死亡率較高，嚴(yán)重威脅人類健康[8-9]。目前胰腺癌的治療包括手術(shù)治療、放化療、靶向治療等，但治療效果較差，5年總體生存率僅為5%[10]。因此，尋找早期診斷胰腺癌的血腫瘤標(biāo)志物，早期積極治療對(duì)延長患者生存預(yù)后時(shí)間具有重要臨床意義。傳統(tǒng)的用于胰腺癌的血腫瘤標(biāo)志物如CA19-9等的敏感性和特異性不高，尚不能用于胰腺癌的早期診斷[11]。因此，有必要深入研究胰腺癌的分子機(jī)制。

miRNA是短的非編碼RNA分子，在RNA聚合酶Ⅱ、Dicer核糖核酸酶作用下成熟，特異性識(shí)別結(jié)合靶基因，調(diào)控靶基因表達(dá)水平。有研究報(bào)道，乳腺癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[13]等多種惡性腫瘤中，miR-21均異常表達(dá)升高，促進(jìn)下游癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。本研究中，胰腺癌患者血漿中miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)。其機(jī)制可能是長鏈非編碼RNA（LncRNA）MEG3對(duì)miR-21表達(dá)調(diào)控有關(guān)。有學(xué)者報(bào)道，LncRNA MEG3可作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-21的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞中LncRNA MEG3表達(dá)降低，導(dǎo)致LncRNA MEG3對(duì)miR-21表達(dá)抑制作用減弱，miR-21的表達(dá)升高[14]。此外，miR-21表達(dá)與腫瘤TNM分期、分化程度有關(guān)，其原因是miR-21抑制下游抑癌基因，如PTEN等的表達(dá)有關(guān)。研究報(bào)道，腫瘤中miR-21上調(diào)能直接抑制PTEN mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤分期升高。而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用miR-21抑制劑顯著上調(diào)PTEN表達(dá)，癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲明顯受到抑制[15]。此外，miR-21能夠通過激活A(yù)kt信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞E-鈣黏素表達(dá)水平降低，而N-鈣黏素等間質(zhì)性表型表達(dá)增加，腫瘤分化程度降低[16]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)[17]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-155表達(dá)增加，通過抑制抑癌基因如PTPRJ的表達(dá)，發(fā)揮腫瘤促進(jìn)的作用。本研究中，胰腺癌患者血漿中miR-155表達(dá)增加，其原因可能與腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子促進(jìn)miR-21的表達(dá)有關(guān)。研究顯示，腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達(dá)增加，能通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的TGF-β1受體，激活SMAD3、SMAD4等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)miR-155的表達(dá)[18]。此外，不同腫瘤分期、腫瘤分化程度患者血漿中miR-155的表達(dá)水平具有明顯差異。其機(jī)制可能與miR-155對(duì)糖原合酶激酶3β（GSK-3β）的表達(dá)調(diào)控作用有關(guān)。研究顯示，miR-155表達(dá)增加后能夠結(jié)合于GSK-3β的3′UTR區(qū)，促進(jìn)GSK-3β的降解，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路的過度活化，引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，腫瘤分期分級(jí)升高[19-21]。本研究進(jìn)一步探討miR-21、miR-155及兩者聯(lián)合檢測在胰腺癌中的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示血漿miR-21、miR-155聯(lián)合檢測與單一指標(biāo)比較，具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，且聯(lián)合檢測對(duì)胰腺癌診斷效能大于單一指標(biāo)，提示聯(lián)合檢測血漿miR-21、miR-155對(duì)于胰腺癌患者具有較高的診斷價(jià)值，有助于提高胰腺癌早期診斷的準(zhǔn)確性。

綜上所述，胰腺癌患者血漿中miR-21與miR-155表達(dá)上調(diào)，miR-21與miR-155的表達(dá)與胰腺癌的腫瘤分期、腫瘤分化程度有關(guān)，聯(lián)合檢測血漿中miR-21、miR-155表達(dá)具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，有望成為新的胰腺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。

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（收稿日期：2019-11-28）