向 陽 鐘占瓊 祝 琦 吳番娜 張 曉△

（1 江油市人民醫(yī)院檢驗科，江油 621700；2 成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，成都 611137；3 成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學實驗教學中心，成都 610500）

中樞神經系統（central nervous system，CNS）損傷初期的炎癥反應和后期星形膠質細胞活化導致的膠質瘢痕是造成神經功能障礙的重要原因[1]。在CNS損傷中，白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）具有神經保護和損傷的雙重作用[2]。初期炎癥反應可以清除細胞碎片，促進損傷區(qū)域修復，但是過度炎癥反應，通常導致細胞進行性壞死。通過適當的抗炎干預措施，使機體維持一定的穩(wěn)態(tài)，有助于CNS損傷的恢復[3-5]。波形蛋白（vimentin， Vim）屬于細胞中間絲（intermediate filaments， IFs）蛋白家族成員[6]。CNS正常時，Vim在星形膠質細胞中表達量很少，但CNS受損后，星形膠質細胞反應性增生，Vim構成星形膠質細胞的骨架結構，

Vim也明顯表達[7]。過度膠質化導致膠質瘢痕的生成，將會抑制神經軸突再生。然而，IL-6和Vim在CNS損傷后的相互關系不清楚，IL-6是否通過調控Vim，影響星形膠質細胞膠質化反應尚未見報道。本實驗在體外制備星形膠質細胞損傷模型，用慢病毒載體介導的RNAi抑制星形膠質細胞IL-6的表達，通過免疫熒光（immunofluorescence）、實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRTPCR）、免疫印跡、MTT實驗探究Vim的表達變化，探討其變化對星形膠質細胞反應性膠質化的影響，最終為臨床治療CNS損傷提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 星形膠質細胞培養(yǎng)和鑒定

取3 d SD大鼠于75%乙醇中浸泡消毒，斷頭入無菌0.01 mol/L PBS培養(yǎng)皿中，夾取大腦皮質入DMEM-高糖培養(yǎng)基，加入0.125%胰蛋白酶充分消化，用10% FBS終止消化，再加DMEM-高糖培養(yǎng)基反復吹打混勻，200目不銹鋼細胞濾網過濾，離心機離心10 min，1 000 r/min。吸棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸，制備單細胞懸液，將單細胞懸液計數稀釋至密度為5×105/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱，每隔3 d全量換液。細胞鋪滿瓶底時，用0.125%胰蛋白酶消化，經過2次傳代，第3次接種于96孔板，接種濃度是5×104/mL；接種于6孔板，接種濃度5×105/mL。通過IF檢測GFAP含量，來驗證細胞純度。當星形膠質細胞密度達到40%可進行病毒轉染。

1.2 細胞分組

實驗分載體組（Vector組）和病毒組（IL-6-RNAi-LV組）。IL-6慢病毒抑制液、陰性對照由華西神經生物研究所提供并予以技術指導。載體組為1 μL陰性對照液加入到100 μL完全培養(yǎng)基中，病毒組為1 μL病毒工作液加入到100 μL完全培養(yǎng)基中，每個孔均加入陽離子聚合物1 μL 1%凝聚胺溶液（polybrene，PB）。24 h后全量換液。轉染后2 d，用qRT-PCR檢測IL-6 mRNA表達，觀察病毒組是否成功抑制IL-6 mRNA。

1.3 星形膠質細胞劃傷模型制備

病毒轉染后2 d做劃痕實驗。用10 μL黃色槍頭在6孔板培養(yǎng)基中劃“井”字，平均間距1 cm，用0.01 mol/L PBS漂洗因劃傷掉落的細胞，然后加入完全培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在劃傷后0、12、24、48 h 4個時間點分別取材進行下一步實驗。

1.4 MTT法

在劃傷后在0、12、24、48 h進行MTT實驗。6孔板中每孔加入100 μL MTT試劑（避光），放入孵箱37 ℃ 4 h。拿出后吸出液體，加入1 mL DMSO，用加樣槍混勻，再將液體移到96孔板，每孔100 μL，放入酶標儀測定490 nm OD值。時間為橫坐標，OD值為縱坐標作圖，比較2組的細胞增殖。

1.5 免疫熒光染色

吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，使用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×1次，再加4%多聚甲醛室溫固定10 min，然 后 用0.01 mol/L PBS漂 洗3 min×3次。加入含3‰Triton X-100的5%羊血清溶液，放入孵箱37 ℃ 30 min。吸掉液體，每孔加入Vim（1∶400，mouse，博士德），GFAP（1∶300，rabbit，博士德），GFAP（1∶300，mouse，博士德）抗體各50 μL，然后將96孔板放入濕盒，再放入冰箱4 ℃過夜。用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。加入熒光二抗：488標記山羊抗小鼠IgG（1∶200）和羅丹明標記山羊抗兔IgG（1∶50）。二抗孵育溫度是37 ℃，30 min。0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。滴加DAPI溶液，盡快使用熒光顯微鏡于暗室中拍照。

1.6 qRT-PCR

吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3次。每孔加入TRIzol溶液0.5 mL，吹打收集混懸液，提取總RNA。采用試劑盒 （Vazyme Biotech， Nanjing， China）將 總RNA逆 轉 錄 成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。設計大鼠內參β-actin，Vim，IL-6的上下游引物序列和探針序列（表1），通過試劑盒（Vazyme Biotech， Nanjing，China）進行定量PCR的測量。擴增條件如下：95 ℃2 min，95 ℃20 s，52 ℃30 s，60 ℃40 s，循環(huán)45次。反應體系在Bio-Rad CFX96TM型實時熒光定量PCR儀上進行。讀取Ct值，采用公式R=2-ΔΔCt計算IL-6和Vim相對表達量。

1.7 免疫印跡檢測

吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3。加入RIPA裂解液，將細胞從孔板上刮下，離心后棄上清， 加入提前解凍的5×SDS PEGF蛋白上樣緩沖液，沸騰變性10 min。本實驗采用12%分離膠和5%濃縮膠，先80 V跑至所有樣品到達濃縮膠時，換120 V電壓，溴酚藍泳動至距膠下緣1 cm以上時，切斷電源，過程約需2 h。PVDF膜用搖床TBST漂洗，10 min×3次，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗Vim（1：2 000，mouse，博士德）和β-actin（1：2 000，mouse，博士德）4 ℃過夜18 h， TBST于搖床漂洗10 min×3次，加入二抗（1：10 000，HRP-羊抗小鼠IgG，博士德），搖床室溫1 h。搖床TBST 15 min×3次。最后加入顯色混合液，于凝膠成像儀器中，采集圖像。

表1 引物和探針序列Tab 1 Sequence of primer and TaqMan probe

1.8 統計學處理

使用SPSS17.0軟件，本實驗所有數據采用x±s表示，2組以上比較時采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊行LSD檢驗，不齊行Dunnett T3檢驗。2組比較時采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 星形膠質細胞培養(yǎng)和鑒定

2.1.1 星形膠質細胞培養(yǎng) 1 d后觀察已有細胞貼壁，有些細胞已有突起伸出（圖1 A）。3 d時細胞數量增加，細胞體積明顯變大，突起長度增加，并且部分細胞交織成網（圖1 B），7 d時，細胞已經基本鋪滿培養(yǎng)瓶，細胞的網絡結構更加明顯（圖1 C）。第2次傳代時第7天， 星形膠質細胞的細胞質更加豐富，細胞之間相互交錯，形成網絡結構（圖1 D）。

2.1.2 星形膠質細胞純度鑒定 傳代2代后，當細胞密度達到60 %～80 %時，進行免疫熒光染色，形態(tài)清晰（圖2，見封三）。隨機選取10個顯微鏡視野，計數藍色熒光的陽性細胞數和紅色熒光的陽性細胞數，然后通過比值來計算星形膠質細胞純度,結果為97%。

圖1 不同培養(yǎng)時間下的星形膠質細胞Fig 1 Astrocytes at different culture time

2.2 qRT-PCR檢測IL-6mRNA表達

通過qRT-PCR檢測慢病毒轉染2 d時病毒組和載體組的IL-6 mRNA相對表達量，結果顯示IL-6-RNAi-LV組的IL-6 mRNA含量（0.000 031±0.000 001）較載體組（0.000 055±0.000 003）顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），表明慢病毒轉染成功，抑制IL-6 mRNA表達。

2.3 MTT檢測星形膠質細胞增殖率

在損傷后24 h、48 h，IL-6-RNAi-LV組的星形膠質細胞增殖率與載體組相比降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 細胞增殖差異比較Fig 3 Comparison of cell proliferation

2.4 免疫熒光檢測星形膠質細胞活性

細胞劃傷后2 d檢測細胞中GFAP，可見其在細胞質和細胞核均高度分布，IL-6-RNAi-LV組綠色熒光強度明顯低于載體組（圖4，見封三）

2.5 劃傷星形膠質細胞后，Vim mRNA和蛋白表達變化及定位

qRT-PCR檢測細胞損傷模型制備后2 d時病毒組和載體組的Vim mRNA相對表達量，結果顯示IL-6-RNAi-LV組（0.003 45±0.001 2）相較載體組（0.006 7±0.001 2）顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

免疫印跡檢測細胞損傷模型制備后2 d時慢病毒組和載體組的Vim 蛋白含量。通過Image J 計算和統計學分析，顯示IL-6-RNAi-LV組相較Vector組在2 d顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。

通過免疫熒光觀察載體組和慢病毒組在細胞損傷模型制備2 d時Vim的定位，可見Vim主要在細胞質高度表達。IL-6-RNAi-LV組綠色熒光強度明顯低于載體組（圖6，見封三）。

圖2 GFAP 免疫熒光染色×400。 A：GFAP+物質（紅色）； B：DAPI 染細胞核呈藍色； C：重合圖像代表星形膠質細胞.圖4 GFAP 免疫熒光染色，×200。A1 ～C1：載體組；A2 ～C2：病毒組。 A：綠色熒光代表星形GFAP 陽性物質； B：細胞核呈藍色；C：重合圖像.圖6 Vim 免疫熒光染色結果，×400。A1 ～C1：載體組；A2 ～C2：病毒組。 A：綠色熒光代表Vim 陽性物質； B：細胞核呈藍色；C：重合圖像.Fig 2 Immunofluorescence staining of GFAP， ×400. A： GFAP+ astrocyte（red）； B： DAPI（ blue） stains the nucleus； C： Merged images.Fig 4 Immunofluorescence staining of GFAP， ×200. A1-C1 ：Vector ；A2-C2 ：IL-6-RNAi-LV. A ：GFAP+ astrocyte（green） ；B： DAPI+ nucleus（blue） ； C： Merged images.Fig 6 Immunofluorescence staining of vimentin， ×400. A1-C1：Vector；A2-C2：IL-6-RNAi-LV. A： vimentin+ astrocyte（green）；B： DAPI+ nucleus（blue） ； C： Merged images.

3 討論

CNS損傷是一種嚴重損傷，因為其復雜的病理生理機制，至今尚無有效的治療措施[8]。然而，CNS損傷后早期炎癥反應和后期瘢痕形成對損傷后運動功能的恢復有重要影響。本研究在體外建立細胞劃傷模型，模擬CNS損傷，通過MTT、免疫熒光、qRT-PCR和免疫印跡檢測，研究IL-6對Vim的調控，了解抑制炎癥因子IL-6是否下調反應性膠質化相關因子Vim，減輕星形膠質細胞膠質化，有益于CNS損傷恢復。

圖5 慢病毒抑制IL-6后vimentin蛋白表達Fig 5 The protein expression of vimentin in astrocytes with IL-6-RNAi-LV

3.1 細胞選擇及模型建立

本實驗選用星形膠質細胞。在人體中，當機體受到損傷后，細胞的反應性膠質化為損傷后的一個基本病理變化，過度膠質化導致膠質瘢痕形成，而膠質瘢痕中最主要的細胞是活化的星形膠質細胞[9]。因此，本實驗選用星形膠質細胞為研究對象。在CNS損傷后星形膠質細胞發(fā)生形態(tài)學、分子功能學的改變，并隨著CNS損傷時間的推移而動態(tài)變化，最初膠質細胞活化是一種防御機制，旨在減少炎癥、重建血腦屏障，最大限度減少和修復最初的損傷[10]，但是當抑制成分超過生長刺激因子，抑制作用占主導時，抑制性成分如硫酸軟骨素蛋白多糖、NG2、諾氨酸激酶等的表達而成為機械性屏障[11]，在嚴重損傷情況下，星形膠質細胞活化就會導致不可逆的膠質瘢痕形成。在CNS內，星形膠質細胞數量最多[11]，并且在CNS發(fā)育成熟后，星形膠質細胞仍然具有分裂能力，在體外進行原代培養(yǎng)比神經元細胞更加容易貼壁，存活率高，并且能夠穩(wěn)定傳代[12]，對外界刺激有良好反應[13]。

本實驗選用劃傷模型。在體外建立SD新生鼠大腦皮質的星形膠質細胞劃傷模型，模擬體內脊髓損傷后膠質細胞反應性增生[14]，劃傷性損傷相比于谷氨酸等興奮性氨基酸造成神經元和膠質細胞損傷更加接近體內組織機械性損傷[15]。

3.2 慢病毒抑制IL-6后Vim表達下調，抑制星形膠質細胞活化

在本實驗中，首先將培養(yǎng)的星形膠質細胞分成病毒組和載體組，在轉染慢病毒后2 d，采用qRTPCR測量IL-6 mRNA表達量，確定轉染是否成功。因為病毒組IL-6的mRNA表達顯著低于載體組，表明慢病毒轉染成功。然后，建立星形膠質細胞劃傷模型。

Vim是細胞骨架的主要成分，對其進行干擾可能有效阻止膠質瘢痕形成。Smith 等[16]通過納米材料轉運siRNA （siRNA-3WJs）抑制神經炎性源因子Lcn2的表達，結果顯示Vim、GFAP表達降低，反應性星形膠質細胞減少。Okada 等[17]使用改良紐約大學沖擊器造成大鼠脊髓鈍挫傷，腹腔注射IL-6R單克隆抗體（MR16-1）抑制IL-6表達，結果顯示MR16-1可以抑制IL-6 JAK/STAT信號通路，降低星形膠質細胞分化，也抑制脊髓損傷后星形膠質細胞的活化，還可以減少炎癥細胞的浸潤，減少瘢痕形成。Lepekhin等[18-19]采用GFAP和Vim基因雙敲除小鼠，在其腦或脊髓損傷后形成的膠質瘢痕中，反應性星形膠質細胞表現出明顯的形態(tài)改變和細胞運動功能缺陷，并且減少膠質瘢痕形成。Larsson 等[20]采用18個月大的GFAP（-/-）Vim（-/-）小鼠為研究對象，雙基因敲除的小鼠海馬齒狀回顆粒層細胞增殖存活率比野生型對照組高34%，神經再生率高36%，提示通過調節(jié)星形膠質細胞的活化，可以促進健康老年小鼠海馬神經再生。劃傷模型建立后，實驗結果表明慢病毒抑制IL-6后Vim表達下調。病毒組細胞在24 h和48 h增殖明顯低于載體組。免疫熒光檢測結果顯示病毒組星形膠質細胞活性程度，弱于載體組。實驗結果提示慢病毒干擾IL-6后，Vim的表達下調，星形膠質細胞的活化受到抑制，從而減少膠質瘢痕形成，增加軸突可塑性。本實驗結果與上述研究保持一致。

在體外實驗中，干擾IL-6的表達能夠下調Vim的表達，干擾星形膠質細胞骨架結構，影響星形膠質細胞反應性膠質化，從而抑制膠質瘢痕生成。然而，人體內的生理病理機制更為復雜，炎癥反應和膠質瘢痕形成之間的相互關系還需要進一步深入探究。