張曉南,普冰清,陳雪江,李東嫻,牛延菲,徐紅貴
(1 云南省藥物研究所,云南 昆明 650111;2 云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心,云南 昆明 650111;3 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650111)
惡性腫瘤(癌癥)是嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全的重大疾病,是繼心血管疾病后的全球第二大死亡原因,每年導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過800萬人。惡性腫瘤特點(diǎn)之一是腫瘤細(xì)胞不受控制的快速增殖,增殖需要DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,因此,DNA是抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)。鉑類藥物就是一類以DNA為作用靶點(diǎn)的無機(jī)抗癌配合物[1]。它們以被動(dòng)擴(kuò)散的方式和借助載銅蛋白(CTR1)的運(yùn)轉(zhuǎn)方式跨過細(xì)胞膜,在細(xì)胞質(zhì)的水介質(zhì)下進(jìn)行水合反應(yīng)、生成高化學(xué)活性的水合配陽離子cis-[A2Pt(II)(H2O)2]2+,擴(kuò)散遷移到細(xì)胞核后,與DNA鳥嘌呤上第7位氮原子以配位鍵的形式結(jié)合,形成與DNA的鏈內(nèi)交聯(lián)和鏈間交聯(lián)cis-A2Pt(II)2+/DNA,從而破壞了癌細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡[2]。
含鉑類藥物的聯(lián)合化療一直是治療胃癌的首選方案,近年來,分子靶向療法在癌癥的治療中取得了極大的成功,但是靶向療法的療效因人而異,特別是胃癌,對靶向療法不敏感,被喻為分子靶向治療的“盲區(qū)”。同時(shí),靶向治療通常與化療聯(lián)用有協(xié)同抗癌效應(yīng),因此,以鉑類藥物為主或參與聯(lián)合化療的方案仍是臨床治療晚期胃癌和預(yù)防胃癌手術(shù)后復(fù)發(fā)的重要方法。但鉑類抗癌藥普遍存在肝腎毒性高,骨髓抑制毒性大,很多老年患者不能耐受,以及交叉耐用性等問題。因此,研制毒性小、對胃癌有較高療效的新型鉑類抗癌藥物仍具有重要社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3-5]。
舒尼鉑的研發(fā)正是以改善鉑類抗癌藥的肝腎毒性和骨髓抑制毒性為目的,從而達(dá)到提高患者的生活質(zhì)量,延長生存期的最終目標(biāo)。舒尼鉑目前已完成了臨床前的研發(fā),進(jìn)入臨床試驗(yàn)申報(bào)階段,在其合成過程中使用了含金屬鈀的催化劑,因此對鈀催化劑殘留量的控制是其質(zhì)量控制中重要的一環(huán)?;诖?,本文建立了舒尼鉑原料藥中的鈀元素含量測定的方法,并進(jìn)行了方法學(xué)研究[6],以期為舒尼鉑和同類的鉑類抗癌藥的新藥研發(fā)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。
AG285型電子天平,瑞典METTLER TOLEDO公司;Speedwave 4微波消解系統(tǒng),德國Berghof公司;7700X電感耦合等離子質(zhì)譜儀,美國安捷倫公司;Advantage 10 Milli-Q超純水發(fā)生器,美國密理博公司。
鈀(Pd)標(biāo)準(zhǔn)液(批號:198016,濃度為1000 μg·mL-1),國家有色金屬及電子材料分析測試中心;內(nèi)標(biāo)溶液(ICP-MS Internal Std Mix,批號:5188-6525),Agilent Technologies;硝酸(優(yōu)級純);去離子水(超純水);供試品:舒尼鉑原料藥,由本實(shí)驗(yàn)室合成,批號:SNB-01。
射頻功率:1600 W;等離子體氣體流量:15 L·min-1;輔助氣流量:1.0 L·min-1;載氣流量1.05 L·min-1;霧化器溫度:2 ℃;采集模式:質(zhì)譜圖;峰型:3個(gè)點(diǎn);積分時(shí)間:0.3~0.9 s。
精密量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用5%稀釋制成每1 mL各含銦元素1 μg的混合溶液,即得。
精密量取標(biāo)準(zhǔn)品液(1000 μg·mL-1)適量,用5%硝酸溶液稀釋制配制成含鈀1500 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。精密吸取上述配制的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量,用5%硝酸稀釋至刻度,制成含鈀質(zhì)量濃度為25、60、90、120、150 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液即得。以上溶液應(yīng)臨用新配。
稱取樣品約0.1 g,精密稱定,置聚四氟乙烯消解罐內(nèi),加硝酸8 mL,混勻,蓋好內(nèi)蓋,旋緊外蓋,浸泡過夜,置微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解,消解程序見表1。待消解完全后,藥液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中,用少量超純水洗滌消解罐3次,合并洗液,用水稀釋至刻度,搖勻,即得。消解所得溶液應(yīng)無色透明,無肉眼可見異物。同法制備樣品空白溶液。
表1 微波消解程序
測定時(shí)選取的同位素為105Pd,以115In作為內(nèi)標(biāo)。儀器的內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管在儀器分析工作過程中始終插入內(nèi)標(biāo)溶液中,依次將儀器的樣品管插入各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中進(jìn)行測定(濃度依次遞增),以待測元素計(jì)數(shù)值與內(nèi)標(biāo)元素計(jì)數(shù)值的比率值(3次讀數(shù)的平均值)為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將儀器的樣品管插入供試品溶液中測定,取3次讀數(shù)的平均值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得相應(yīng)的樣品溶液中待測元素濃度。在同樣的分析條件下進(jìn)行空白試驗(yàn),扣除空白干擾。
2.6.1 線性試驗(yàn)
取標(biāo)準(zhǔn)溶液測定,以鈀元素濃度為橫坐標(biāo),鈀元素計(jì)數(shù)值和對應(yīng)銦元素計(jì)數(shù)值的比值為縱坐標(biāo),繪制曲線。結(jié)果表明鈀元素在0~150 μg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.008x+0.007,r=0.999。
2.6.2 檢測限與定量限測定
制備樣品空白溶液平行11份,依次按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定,計(jì)算11次空白溶液中鈀元素濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ。3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為檢出限,10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為定量限,結(jié)果鈀元素檢出限為0.0050 μg·L-1,定量限為0.0167 μg·L-1;按取樣品0.1 g,定容至50 mL計(jì),檢出限為0.0025 μg·g-1,定量限為0.0084 μg·g-1,可以滿足檢測要求。
2.6.3 回收率試驗(yàn)
稱取供試品6份,每份約0.1 g,精密稱定(批號:SNB-01已測得含Pd 2.21 μg·g-1),加入約和樣品原含量相等量的鈀元素標(biāo)準(zhǔn)品0.2 μg,然后按供試品溶液處理方法同法處理,將處理好的供試品溶液按含量測定方法同法測定,計(jì)算回收率,由結(jié)果可知,回收率為96.79%~112.98%,RSD為8.60%(n=6),符合規(guī)定[6]。
2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)
稱取同一批號(批號:SNB-01)的樣品6份,精密稱定,消解定容后按“2.1”項(xiàng)下條件測定。計(jì)算得鈀平均含量為2.21 μg·g-1,RSD為2.40%(n=6),結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。
2.6.5 耐用性試驗(yàn)
精密稱取同一批號(批號:SNB-01)的樣品6份,其中2份于測定前2天消解,密封后冷藏保存;2份于測定前1天消解,密封后冷藏保存;另外2份測定當(dāng)天消解,6份樣品于同一天按“2.1”項(xiàng)下條件測定,觀察鈀元素穩(wěn)定性,計(jì)算得鈀平均含量為2.33 μg·g-1,RSD為4.09%,表明72小時(shí)內(nèi),鈀元素在溶液中穩(wěn)定性能夠符合測定的要求。
按“2.1”項(xiàng)下條件測定 3 批樣品(批號:SNB-01、SNB-02、SNB-03)結(jié)果鈀元素含量分別為2.21、3.61、1.78 μg·g-1。
《中國藥典》2015年版尚未對鈀殘留做出限量規(guī)定,在注射劑中只是對5種重金屬進(jìn)行了限定:按每日最大使用量計(jì)算,鉛不得超過12 μg,鎘不得超過3 μg,砷不得超過6 μg,汞不得超過2 μg,銅不得超過150 μg。ICH Q3D元素雜質(zhì)指南[7]規(guī)定,鈀的安全風(fēng)險(xiǎn)等級為2B級,注射用制劑中鈀元素的PDE標(biāo)準(zhǔn)(每日允許暴露量)為10 μg·d-1;美國藥典通則 USP<232>[8]也明確規(guī)定注射用制劑中鈀元素的PDE標(biāo)準(zhǔn)(每日允許暴露量)為10 μg·d-1。舒尼鉑預(yù)計(jì)的最高臨床用量為0.1g·d-1,因此舒尼鉑原料藥的鈀含量最高限度應(yīng)為10 μg/0.1 g=100 μg·g-1。本實(shí)驗(yàn)的3批舒尼鉑原料藥中的鈀含量分別為2.21、3.61、1.78 μg·g-1,遠(yuǎn)低于這個(gè)限度,因此可以認(rèn)為舒尼鉑原料藥生產(chǎn)工藝中的鈀殘留量控制是比較成功的。
本文采用的微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法樣品消耗量低,靈敏度高,操作簡便,完全能滿足舒尼鉑原料藥中鈀殘留量控制的要求,可作為標(biāo)準(zhǔn)方法,列入相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)也可為其它類似藥物中的金屬催化劑殘留量控制提供思路。
在試驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn),鉑元素在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)中存在較為嚴(yán)重的記憶效應(yīng),如需檢測鉑含量較高的樣品,建議使用專用的樣品管、霧化器、矩管、采樣錐,并在進(jìn)樣完成后用10%的硝酸溶液沖洗進(jìn)樣通道30 min以上。