湯須崇，劉希敏，盧紹基，鄧愛華，牛文靜

(1 華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021；2 廈門塔斯曼生物工程有限公司，福建 廈門 361027；3 湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl)屬于蘭科開唇蘭屬植物，又名金線絨、金石松、金線草、鳥人參、金蠶等，是我國一種珍貴的傳統(tǒng)中藥材，以全草入藥，味甘、性平[1-2]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮具有多種藥理活性可用于高血壓、糖尿病、心臟病、腎炎、腫瘤等的治療[3]。金線蓮富含黃酮類化合物、多糖、生物堿、揮發(fā)油、甾體化合物、氨基酸等多種植物活性成分[4]。金線蓮臨床藥理價(jià)值是基于其中主要活性物質(zhì)多糖類、黃酮類及黃酮苷元，同時(shí)黃酮類和多糖類化合物也是檢測天然產(chǎn)物活性成分的重要指標(biāo)[5]。黃酮類化合物又稱黃酮體、類黃酮等，目前金線蓮中已被發(fā)現(xiàn)的黃酮類有30多種，主要以槲皮素、山奈酚、異鼠李糖及其衍生物為主[6-7]。金線蓮總黃酮具有多種藥理作用，具有降血糖、降血壓、抗氧化、保肝、抗炎癥和鎮(zhèn)痛等的藥用功效。李明等[8]發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物可改善腸道菌群治療炎癥腸病；白鷺等[9]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類可通過抗炎等作用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用；李鴻等[10]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該類化合物可起到抗動(dòng)脈硬化作用；王虹等[11]發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物能起到調(diào)節(jié)免疫信號(hào)通路治療相關(guān)免疫疾病的作用；研究還顯示黃酮類還具有抗乳腺癌[12]，抗肝癌[13]，抗肺癌[14]等作用。近年來金線蓮的研究主要集中在藥理活性及多糖提取與應(yīng)用，而有關(guān)金線蓮總黃酮的研究相對(duì)較少但其又具有巨大的利用價(jià)值，值得對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高金線蓮中總黃酮得率，為金線蓮中總黃酮深入研究提供前提條件。

目前金線蓮總黃酮的提取方法主要有：醇提、水提、堿提、系統(tǒng)溶劑提取以及超聲波、微波、酶、超臨界萃取等[15-22]。超聲波提取是以溶液為介質(zhì)發(fā)出一定頻率的超聲波產(chǎn)生空化作用和機(jī)械效應(yīng)，這種作用可使待提取中藥材細(xì)胞壁被破壞，提取物溶出到提取液中。超聲條件溫和不會(huì)破壞有效成分結(jié)構(gòu)，且操作簡便，能耗低提取效率高[23]。本研究采用超聲波輔助溶劑法提取技術(shù)，運(yùn)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)以提取溫度、超聲時(shí)間、料液比以及乙醇濃度為影響因素的四因素三水平實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，建立回歸方程，以響應(yīng)面分析法(RSM)[24]對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)金線蓮總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究其藥理活性、作用機(jī)制提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線蓮，廈門塔斯曼生物工程有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；氫氧化鈉，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為藥用級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

600Y老本行多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；DHG-9075A鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AR1502CN電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；KQ5200E超聲波清洗儀(功率300 W)，昆山市超聲儀器有限公司；UV-8000紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Hei-VAP Precision旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道夫公司；DK-S22電熱恒溫水浴鍋，上海精宏儀器有限公司；SHB-IIIT循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

2 方 法

2.1 金線蓮總黃酮的提取工藝

稱取5 g的金線蓮干燥樣品，加入一定量的乙醇溶液，在一定的溫度和功率超聲處理一定時(shí)間，過濾，續(xù)濾液測定其總黃酮含量。

2.2 總黃酮含量的測定[25]

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用60%乙醇配置成0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，加入2 mL 60%乙醇溶液再加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇定容至10.0 mL，靜置15 min。以蘆丁含量(mg/g)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到回歸方程為Y=1.4729X+0.0033(R2=0.9989)。

圖1 蘆丁含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 金線蓮黃酮得率的計(jì)算

準(zhǔn)確吸取1.0 mL待測樣品于10 mL比色管中，加入60%乙醇溶液2 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，靜置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，用60%乙醇定至10.0 mL，靜置15 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液作為空白對(duì)照，于510 nm處測定其吸光度。按下式計(jì)算樣品中總黃酮的提取量：

總黃酮提取量=CD/m

式中，C為回歸計(jì)算得到的總黃酮含量，mg/mL；D為稀釋倍數(shù)；m為稱取金線蓮樣品的質(zhì)量，g。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別考察溫度、超聲時(shí)間、料液比以及乙醇濃度等4個(gè)單因素對(duì)金線蓮總黃酮提取量的影響。

2.3.1 溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，料液比為(g∶mL)1∶40，超聲時(shí)間50 min，分別于溫度20、30、40、50、60、70 ℃進(jìn)行超聲提取，測定提取液中總黃酮提取量。

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，料液比為(g∶mL)1∶40，溫度設(shè)定50 ℃，分別提取20、40、60、80、100、120 min，測定提取液中總黃酮提取量。

2.3.3 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，溫度設(shè)定50 ℃，超聲時(shí)間50 min，分別以料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45進(jìn)行超聲提取，測定提取液中總黃酮提取量。

2.3.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響

稱取干燥金線蓮樣品，料液比為(g∶mL)1∶40，溫度設(shè)定50 ℃，超聲時(shí)間50 min，分別以乙醇濃度0、20%、40%、60%、80%、95%進(jìn)行超聲提取，測定提取液中總黃酮提取量。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在根據(jù)單因素考察實(shí)驗(yàn)選取溫度(A/℃)、超聲時(shí)間(B/min)、料液比(C/g:mL)和乙醇濃度(D/%)為因素，金線蓮中總黃酮提取率為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取金線蓮藥材3份，按照最佳工藝條件進(jìn)行提取，按照“2.1項(xiàng)金線蓮總黃酮的提取工藝”，按“2.2總黃酮含量測定”項(xiàng)測定金線蓮總黃酮提取率。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

超聲波提取溫度對(duì)金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖2。由圖2可知，溫度對(duì)金線蓮總黃酮的提取量具有一定的影響，在20～60 ℃隨著溫度的增加逐漸增加，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)總黃酮提取量最高；當(dāng)提取溫度升至70 ℃時(shí)，總黃酮提取量呈下降趨勢，這可能是由于溫度超過60 ℃會(huì)引起乙醇溶劑的蒸發(fā)，降低了乙醇溶劑的濃度，導(dǎo)致總黃酮溶出量下降。因此，提取溫度最好控制在60 ℃。

圖2 溫度變化對(duì)總黃酮提取的影響

3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

超聲時(shí)間對(duì)金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖3。圖3顯示，超聲時(shí)間較短時(shí)，總黃酮提取量較小，可能時(shí)間較短不利于金線蓮總黃酮的提取。隨著超聲時(shí)間的增加其提取量逐漸增加，超聲波的空化作用加速了金線蓮細(xì)胞內(nèi)總黃酮的溶出，當(dāng)超聲時(shí)間為80 min時(shí)總黃酮提取量最高，之后就有下降的趨勢，可能是超聲時(shí)間過長導(dǎo)致金線蓮中其他成分的溶出，從而降低了總黃酮溶出的比例。又因?yàn)榭傸S酮提取量變化不大，選擇40，50，60 min來進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化考察。

圖3 超聲時(shí)間變化對(duì)總黃酮提取的影響

3.1.3 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

超聲提取料液比對(duì)金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖4。由圖4可知，總黃酮的提取量隨著料液比的增加而逐漸上升到趨于平穩(wěn)。料液比為1∶35，1∶40，1∶45時(shí)，從圖4看到總黃酮提取量有微弱增加但相差不大，基本已趨于平穩(wěn)。在保證總黃酮提取量的基礎(chǔ)上，考慮到節(jié)約溶劑的用量及成本問題，選擇1∶40為考察最佳料液比。

圖4 料液比變化對(duì)總黃酮提取的影響

3.1.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響

超聲提取乙醇濃度對(duì)金線蓮總黃酮提取效果的影響見圖5。由圖5可知，金線蓮總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，對(duì)總黃酮的提取效果最好，乙醇濃度提升至95%時(shí)，總黃酮提取量反而減少。其原因可能為總黃酮包括黃酮及其苷類化合物，在乙醇濃度較低時(shí)，表現(xiàn)出水的極性，具有羥基的苷類化合物先溶出；隨著乙醇濃度逐漸提高，極性降低，疏水性的逐漸溶出；乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，會(huì)增加相關(guān)雜質(zhì)溶出降低了總黃酮提取率。因此，選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%最佳。

圖5 乙醇濃度變化對(duì)總黃酮提取的影響

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2中金線蓮總黃酮提取量(Y)及四個(gè)影響因素進(jìn)行二次回歸模型擬合，其結(jié)果見表3可知。

表3 響應(yīng)面分析法方差分析

對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的二元多項(xiàng)回歸方程為：

R=5.84-0.078A+0.15B+0.15C+0.59D+0.056AB+0.25AC-0.089AD-0.49BC-0.23BD-0.44CD-0.37A2-0.25B2-0.33C2-0.41D2

由表3分析結(jié)果看，整體模型的P<0.01，表明該二次方程模型極顯著。而且方程的失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不大，可用于金線蓮總黃酮提取實(shí)驗(yàn)預(yù)測。因素D，BC，CD，A2，D2為顯著影響因素。兩兩因素之間的交互作用中，超聲時(shí)間和料液比的交互作用、料液比和乙醇濃度的交互作用對(duì)金線蓮黃酮提取效果影響顯著。

由結(jié)果可知，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9325，說明因變量和自變量之間線性關(guān)系顯著且擬合度較好實(shí)驗(yàn)誤差影響較小。說明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化的金線蓮總黃酮提取工藝準(zhǔn)確可靠。

金線蓮總黃酮提取的等高線圖與響應(yīng)面3D圖見圖6。直觀地看交互作用的響應(yīng)面曲線圖就能發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。在響應(yīng)面曲線圖中交互作用影響總黃酮提取率的顯著性與響應(yīng)面的坡度相關(guān)，曲面圖中若曲面坡度陡峭則因素發(fā)生較小變化時(shí)總黃酮提取率數(shù)值就會(huì)改變較大，那么兩個(gè)因素結(jié)合在一起對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。圖6(i)中，控制AD兩因素不變，B超聲時(shí)間與C料液比交互作用導(dǎo)致曲面坡度陡峭即總黃酮提取率變化較大。

圖6 金線蓮總黃酮提取響應(yīng)面分析等高線(a,c,e,h,j,l)及響應(yīng)面(b,d,f,i,k,m)

3.3 最佳提取工藝

根據(jù)Expert 8.0.6 軟件分析結(jié)果，金線蓮黃酮的最佳提取工藝為：提取溫度45.01 ℃，超聲時(shí)間57.77 min，料液比為1∶30，乙醇濃度為80%，此條件下金線蓮黃酮提取率預(yù)測值為6.25 mg/g。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為確保該工藝的穩(wěn)定性與合理性，根據(jù)響應(yīng)面法得出的最佳提取工藝條件進(jìn)行三組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，按照2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，測定金線蓮總黃酮含量。為方便實(shí)驗(yàn)具體操作，將提取溫度設(shè)定為45 ℃，超聲超聲時(shí)間58 min，料液比為1∶30，乙醇濃度為80%。實(shí)際測得金線蓮黃酮平均提取量為6.20 mg/g，與理論預(yù)測值6.25 mg/g相比無顯著性差異(P<0.01)。因此，采用Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的金線蓮黃酮提取工藝條件穩(wěn)定可行，準(zhǔn)確可靠。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié) 論

本研究采用響應(yīng)面法(Design-Expert軟件)[26]考察金線蓮中黃酮的提取工藝，并且根據(jù)二次方程模型分別做出了試驗(yàn)因素間交互作用的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖。結(jié)果顯示，二次方程的模擬回歸差異顯著，表明實(shí)驗(yàn)建立模擬回歸方程能較好地反映影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。

本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素試驗(yàn)分析不同因素對(duì)金線蓮總黃酮提取量的影響，確定了合適的提取條件；再根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以金線蓮總黃酮提取量為響應(yīng)值，溫度(A/℃)、超聲時(shí)間(B/min)、料液比(C/g∶mL)和乙醇濃度(D/%)為影響因素設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)響應(yīng)值結(jié)果分析，獲得金線蓮總黃酮最佳提取工藝為：提取溫度 45 ℃，超聲超聲時(shí)間58 min，料液比為1∶30，乙醇濃度為80%。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，與模型預(yù)測值基本相符，證明了該工藝的可行性。該提取工藝可為金線蓮總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用研究提供科學(xué)依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。