冀慧穎，李雪兒，李明華

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)和對(duì)食品安全性要求的日益提高，要求以天然防腐劑取代化學(xué)防腐劑的呼聲越來(lái)越強(qiáng)烈。微生物代謝產(chǎn)物作為天然防腐劑的重要來(lái)源之一，因其安全性高、抑菌譜廣、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)而日益受到科研工作者的青睞。在眾多微生物中，乳酸菌作為國(guó)際公認(rèn)安全級(jí)(GRAS)微生物，其多種代謝產(chǎn)物在防腐行業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力，如細(xì)菌素[1]、乳酸[2]和苯基乳酸(PLA)[3]等物質(zhì)。

PLA具有安全性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，在食品、飼料和藥品行業(yè)中具有重大的應(yīng)用潛力[4]。在能夠合成PLA的多種乳酸菌中，乳桿菌(Lactobacillus)因易培養(yǎng)、合成效率高，已受到越來(lái)越多科技工作者的關(guān)注。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)Lactobacillus發(fā)酵條件優(yōu)化[5]、菌種誘變[6]、細(xì)胞透性化[7]等手段，使PLA的產(chǎn)量得到較大程度的提高。在本研究中，將對(duì)植物乳桿菌(L.plantarum)靜息細(xì)胞催化苯丙酮酸(PPA)得到的PLA進(jìn)行分析，并對(duì)其抑制細(xì)菌和霉菌的活性進(jìn)行初步研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 菌株與試劑

植物乳桿菌(L.plantarum)，本實(shí)驗(yàn)室分離保存[8]；大腸桿菌(Escherichiacoli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)和黃曲霉(Aspergillusflavus)菌株購(gòu)于上海保藏生物技術(shù)中心。MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)及其相應(yīng)固體培養(yǎng)基均購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。PPA、D-PLA和L-PLA購(gòu)于阿拉丁試劑公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HP1100高效液相色譜儀(HPLC)，美國(guó)安捷倫；ZD85A恒溫振蕩器，江蘇金壇；DNP-9052恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏；R1005旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海越眾；722G分光光度計(jì)，上海精科；AL104電子天平，上海梅特勒-托利多；MNT-150數(shù)顯游標(biāo)卡尺，德國(guó)美耐特。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苯基乳酸生物催化制備

應(yīng)用植物乳桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化PPA制備PLA[9]，轉(zhuǎn)化完成后，將轉(zhuǎn)化液于4 ℃、10000 rpm離心機(jī)內(nèi)離心10 min后，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃下真空濃縮至原體積的十分之一，然后在濃縮液中按1∶1(v/v)比例加入乙酸乙酯萃取，將萃取液合并后加入適量Na2SO4除水，最后應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯即得PLA粗提物。將獲得的產(chǎn)物用大賽璐手性柱OB-H進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為己烷/異丙醇/三氟乙酸(98/2/0.05)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為25 ℃。

1.3.2 苯基乳酸最低抑菌濃度測(cè)定

采用倍半稀釋法測(cè)定PLA對(duì)細(xì)菌和霉菌的最低抑制濃度(MIC)[10]。將LB培養(yǎng)基分裝至多支試管，每支試管加培養(yǎng)基10 mL，然后加無(wú)菌PLA粗提物至終濃度分別為0.5～10 mg/mL，再加入50 μL細(xì)菌新鮮培養(yǎng)液，37 ℃、150 rpm搖床內(nèi)培養(yǎng)18 h；將霉菌孢子加到含同等濃度PLA的PDB培養(yǎng)基中，使孢子濃度約1×105CFU/mL，28 ℃、150 rpm搖床內(nèi)培養(yǎng)24 h。根據(jù)細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)情況及吸光值確定PLA的最低抑菌濃度。

1.3.3 苯基乳酸對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線影響的測(cè)定

根據(jù)PLA對(duì)細(xì)菌的抑菌能力，分別測(cè)定其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響。將過(guò)濾除菌的PLA加入瓶裝量為150 mL的500 mL三角瓶?jī)?nèi)，至終濃度分別為0.5 MIC和1 MIC，然后在三角瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)至16 h的新鮮細(xì)菌種子培養(yǎng)液，搖勻后于搖床內(nèi)37 ℃、180 rmp條件下培養(yǎng)至24 h，定時(shí)取樣于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 苯基乳酸對(duì)霉菌孢子萌發(fā)的影響

將擴(kuò)展青霉和黃曲霉分別接種于PDA培養(yǎng)基試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)至產(chǎn)生大量分生孢子后，加入無(wú)菌水將分生孢子輕輕洗下，振蕩均勻后用無(wú)菌水稀釋至濃度為1×105CFU/mL備用。分別取0.5 mL孢子液和濃度為1 MIC和2 MIC的PLA0.5 mL混合均勻，取100 μL混合液滴于凹面載玻片，將載玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)28 ℃保濕培養(yǎng)，直至空白對(duì)照孢子萌發(fā)率高于95%時(shí)，檢查各處理孢子萌發(fā)情況，以孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑時(shí)視為萌發(fā)[11]。顯微鏡下隨機(jī)檢查3個(gè)視野，記錄孢子總數(shù)和萌發(fā)數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.3.5 苯基乳酸對(duì)霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響

應(yīng)用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定PLA對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響[12]。制備含有不同濃度PLA的PDA固體平板，以無(wú)菌水為對(duì)照。用打孔器從培養(yǎng)72 h的霉菌菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，然后菌絲面朝下接種于對(duì)照及含PLA的PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)96 h后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯基乳酸粗提產(chǎn)物的檢測(cè)

PLA具有兩種不同的構(gòu)型，即D型和L型，其中D-PLA抑菌能力稍強(qiáng)。PPA經(jīng)過(guò)植物乳桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化完成后，經(jīng)過(guò)粗提，粗提物由手性柱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，PPA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別在洗脫19.38 s和23.09 s時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)峰，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可知，這兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物分別為D-PLA和L-PLA。由此可見(jiàn)，PPA經(jīng)過(guò)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)物主要為D-PLA和L-PLA，且D-PLA含量較高。

圖1 苯丙酮酸植物乳桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析

2.2 苯基乳酸對(duì)細(xì)菌、霉菌的最低抑制濃度

PLA對(duì)兩種細(xì)菌和霉菌的MIC如表1所示。由表1可以看出，PLA對(duì)細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)均有明顯的抑制能力，其中對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為4 mg/mL，而對(duì)擴(kuò)展青霉和黃曲霉的MIC分別為6 mg/mL和8 mg/mL。由表1還可以看出，PLA對(duì)供試霉菌的MIC比供試細(xì)菌高，這說(shuō)明PLA對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制能力要明顯優(yōu)于霉菌。

表1 PLA對(duì)細(xì)菌和霉菌的最低抑制濃度

2.3 苯基乳酸對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

為了進(jìn)一步確定PLA對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制程度，分別測(cè)定了不同PLA濃度下大腸桿菌和金黃色葡萄球的生長(zhǎng)情況，供試PLA濃度分別為0.5 MIC和1 MIC，即2 mg/mL和4 mg/mL，以無(wú)菌水做對(duì)照，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)基內(nèi)不加PLA時(shí)，兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)速度都較快，在培養(yǎng)4 h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再培養(yǎng)10 h后達(dá)到穩(wěn)定期，OD600分別為2.22和2.41。而培養(yǎng)基內(nèi)存在0.5 MIC PLA時(shí)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均受到顯著的抑制，其中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期由4 h推遲到10 h，培養(yǎng)至24 h時(shí)，菌體濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照，OD600僅為1.23和1.32。當(dāng)PLA濃度提高到1.0 MIC時(shí)，兩種細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)。由此可以看出，PLA對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制能力是比較強(qiáng)的。

圖2 PLA對(duì)大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)生長(zhǎng)的影響

2.4 苯基乳酸對(duì)霉菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的影響

霉菌的繁殖可通過(guò)孢子和菌絲斷裂兩種方式進(jìn)行，因此，實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定PLA抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)兩種方式確定該物質(zhì)的抗霉活性。

圖3(a)表明，PLA對(duì)擴(kuò)展青霉和黃曲霉分生孢子萌發(fā)均具有顯著的抑制活性。在對(duì)照處理孢子萌發(fā)率大于95%時(shí)，0.5 MIC PLA處理的擴(kuò)展青霉和黃曲霉分生孢子萌發(fā)率僅為43.34%和51.25%，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率分別達(dá)54.38%和46.05%。當(dāng)將PLA濃度提高到1.0 MIC時(shí)，僅有少量孢子萌發(fā)，抑制率高達(dá)95%以上。

圖3 PLA對(duì)霉菌孢子萌發(fā)(a)和菌絲生長(zhǎng)(b)的影響

PLA對(duì)擴(kuò)展青霉和黃曲霉菌絲生長(zhǎng)也有顯著的抑制活性，如圖3(b)所示。在對(duì)照平板中，供試霉菌菌絲能夠快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)至96 h時(shí)，菌落直徑即達(dá)23～25 mm，而在含有0.5 MIC PLA的平板上，菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制，擴(kuò)展青霉和黃曲霉菌落直徑分別為16.7 mm和14.2 mm，菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為42.08%和49.17%，當(dāng)PLA濃度提高到1.0 MIC時(shí)，對(duì)兩種霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制率分別提高到了79.21%和85.08%。由此可以看出，PLA對(duì)霉菌菌絲生長(zhǎng)也具有明顯的抑制活性，且黃曲霉較擴(kuò)展青霉對(duì)PLA更加敏感。

3 結(jié) 論

應(yīng)用植物乳桿菌靜息細(xì)胞，可將PPA轉(zhuǎn)化為PLA，且D-PLA較L-PLA含量高。PLA能夠顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)、霉菌孢子萌發(fā)，還具有較高的抑制菌絲生長(zhǎng)的活性，展現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌能力。