吳旭錦，朱小甫，熊忙利，張文娟，尚紅梅，楊 萍

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，咸陽市動物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點實驗室，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西 咸陽 712000)

鴿皰疹病毒(Pigeonherpesvirus,PiHV)在分類上屬于皰疹病毒科，但目前為止尚未歸入亞科和屬[1]。鴿子是PiHV的自然宿主，有報道長尾小鸚鵡能夠感染，雞、鴨、金絲雀對PiHV有抵抗力[2]。鴿自然感染表現(xiàn)為精神萎靡，采食下降，以結(jié)膜炎和鼻炎為特征，對鴿群健康危害較大，PiHV感染導(dǎo)致鴿群死淘增加，帶來了一定的經(jīng)濟損失[3]。近年來，我國肉鴿消費量急劇上漲，賽鴿競翔活動參與越來越廣泛，鴿子的飼養(yǎng)量迅速增長[4～7]。但長期以來，學(xué)界對鴿皰疹病毒感染研究資料缺乏，對該病的病原基因特征、診斷方法、防控措施等方面研究薄弱[8]。本課題組從臨床發(fā)病鴿群中分離到1株P(guān)iHV，進行了基因特征分析，以期為臨床防控PiHV感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 組織病料主要包括肝臟、脾臟、腎臟及肺臟，采集自陜西省咸陽市某賽鴿愛好者飼養(yǎng)的鴿群疑似PiHV感染病例。

1.1.2 SPF雞胚 SPF雞蛋，北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，本課題組自行孵化雞胚，用于病毒分離。

1.1.3 試劑 DNAiso、RNAiso、rTaq酶、dNTP等分子生物學(xué)試劑，購自大連寶生物；pGEM-T easy載體克隆試劑盒，購自Promega公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，購自上海生工；DH5ɑ大腸埃希菌由咸陽市動物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公開的PiHV基因序列KX589235/NC034266，針對UL30基因設(shè)計了1對引物，UL30-F：5’-GCTGTGTTTCGATATCGAGTGC-3’， UL30-R：5’-TCCAGCAAGACGGCCTGATC-3’，預(yù)期擴增片段1 326 bp。引物由上海生工合成，用DEPC處理水稀釋到20 μmol·L-1工作濃度，用于PiHV UL30基因序列擴增分析。

1.2.2 病例觀察 2019年4月，陜西省咸陽市某賽鴿愛好者飼養(yǎng)的賽鴿發(fā)病，課題組進行了臨床診斷并進行了病理解剖，無菌操作采集組織病料備用。

1.2.3 病料處理與常見病原檢測 將采集的組織樣品加約5倍體積滅菌生理鹽水剪碎，研磨呈糊狀，10 000 g離心10 min，取上清液-70 ℃保存?zhèn)溆?。采用課題組建立的新城疫、H9禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎PCR /RT-PCR檢測方法進行檢測，排查常見呼吸道病原感染情況。

1.2.4 病毒分離 給處理好的組織病料上清液加入雙抗，至終濃度含青霉素、鏈霉素各2 mg·mL-1，室溫靜置30 min。選擇9日齡SPF雞胚，尿囊腔途徑接種上清液0.2 mL，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化，每8 h照胚一次。24 h內(nèi)死胚棄去，收獲死亡雞胚的尿囊液、絨毛尿囊膜，孵化4 d后仍未死亡雞胚凍死后收獲。研磨收獲的絨毛尿囊膜，10 000 g離心5 min，收上清液。按照上述方法連續(xù)傳代直至雞胚出現(xiàn)規(guī)律性死亡。

1.2.5 傳代病毒UL30基因PCR擴增 按照DNAiso試劑說明提取DNA。PCR擴增體系：DNA溶液 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，UL30-F、UL30-R各0.5 μL，rTaq酶0.5μL，超純水補足至總體積25.0 μL。PCR程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。取5.0 μL產(chǎn)物電泳后成像系統(tǒng)中觀察。

1.2.6UL30基因克隆測序與分析 按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明將獲得的DNA片段純化，連接pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后挑取單個菌落，37℃搖動培養(yǎng)12 h，PCR鑒定陽性后提取質(zhì)粒，酶切鑒定后測序，將獲得序列和參考序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病鴿臨床癥狀、剖檢變化以及常見病毒檢測

病鴿咳嗽、甩鼻，鼻孔有黏液，結(jié)膜潮紅。剖檢發(fā)現(xiàn)，鴿子口腔有大小不一的黃色干酪團塊附著；肺臟充血；肝腫，被膜緊張，表面有白色壞死區(qū)域；胰腺稍腫、潮紅。其他臟器無肉眼可見變化。NDV、AIV H9、ILTV、副雞嗜血桿菌PCR /RT-PCR檢測均為陰性。

2.2 病毒分離結(jié)果

尿囊腔接種連續(xù)傳代至第3代后，雞胚接種48-72h集中死亡。剖檢可見胚體皮膚有點狀出血，肝臟腫脹，邊緣鈍圓，被膜緊張，顏色發(fā)黃并有壞死區(qū)或壞死點。

2.3 傳代病毒UL30基因PCR擴增結(jié)果

對收獲的尿囊液、絨毛尿囊膜進行病毒PCR擴增，電泳結(jié)果表明從樣本中成功擴增出了1326bp的目的條帶(圖1)，證實病毒分離成功，命名為XY2019株。

2.4 UL30基因測序與分析結(jié)果

回收UL30基因片段，連接pGEM-T easy載體，構(gòu)建質(zhì)粒并酶切鑒定，結(jié)果顯示酶切片段大小符合預(yù)期結(jié)果(圖2)。

鑒定正確的陽性質(zhì)粒測序后成功獲得了XY2019株1 326 bp長度的UL30基因片段，利用DNAStar軟件，將獲得序列與GenBank中已知參考序列比對，同源性結(jié)果見圖3，系統(tǒng)發(fā)生樹見圖4。

GenBank中PiHVUL30基因參考序列僅有4株，參考序列BJ株分離于中國北京市，登錄號KC544263，來源于鴿；HLJ株分離于中國黑龍江省，登錄號KX589235，來源于野鴿；S-18株分離于墨西哥，登錄號NC024450，來源于獵鷹；登錄號AF141890無毒株名，分離于德國，來源動物未提供。圖3中，XY2019株UL30基因與這4株參考序列同源性在99.9%～100%之間。圖4顯示，比對序列形成2個大分支，XY2019、HLJ、S-18、BJ株處在一個分支上，而AF141890單獨在一個分支上。

3 討論

PiHV是一種鴿群重要的病原，最早于1936年在獵鷹體內(nèi)分離成功[9]，但迄今學(xué)界對其研究仍極為有限。趙盼盼[10]分離了野鴿皰疹病毒HLJ株，并克隆了UL27基因，進行了序列變異分析。薛媚等[11]參考GenBank公開的PiHV基因信息，設(shè)計檢測引物，優(yōu)化了PCR反應(yīng)條件，建成了一種PiHV PCR診斷方法，并進行了臨床應(yīng)用診斷。筆者研究首先通過PCR/RT-PCR方法排除了新城疫、H9禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎等有呼吸道癥狀傳染病感染的可能性，然后利用PiHV能感染9-11日齡雞胚的特點，通過SPF雞胚連續(xù)3次傳代，成功從賽鴿病料中分離到了PiHV野毒株XY2019株。通過PCR技術(shù)成功擴增了XY2019株UL30基因1 326 bp片段，序列比對分析表明，該毒株與和參考序列高度同源，這4株參考毒株分離時間、地域跨度很大，提示無論是來源于不同動物種類、不同分離國家或地區(qū)的PiHV UL30基因均高度保守，遺傳性高度穩(wěn)定?；蜻M化樹顯示，參比毒株形成2個大分支，XY2019、HLJ、S-18、BJ株處在一個分支上，而AF141890單獨在一個分支上，表明該毒株遺傳進化上與其他毒株存在一定差異。由于對PiHV基因序列研究尚不充分，公開的基因序列過少，尚不能構(gòu)建精細的進化圖譜。筆者研究分離成功XY2019株，為進一步研究毒株全基因序列、開發(fā)快速診斷方法、疫苗研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。