賀立虎，房海珍，李娟麗，薩達(dá)提·吾買爾

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 鳳翔 721406;3 新疆阜康市職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，新疆 阜康 831500)

蛹蟲草(CordycepsmilitarisLink)隸屬于蟲草科(Cordyycepscipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，蟲草素、蟲草酸、多糖、SOD酶等是蟲草類真菌中主要活性物質(zhì)[1～3]，具有提高免疫力、抑制腫瘤等多種功效[4～6]。但野生冬蟲夏草產(chǎn)量較低，價(jià)格高達(dá)每千克二十余萬元，資源也日趨減少，致使其價(jià)格不斷上漲。而蛹蟲草為人工培養(yǎng)，栽培技術(shù)日益成熟，已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，價(jià)格僅為100元·kg-1。但是由于菌種退化和人工培養(yǎng)環(huán)境影響因素較多，產(chǎn)量和品質(zhì)仍是目前蛹蟲草生產(chǎn)需要解決的問題。四甲基戊二酸可通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝，加快生物體生長，達(dá)到增產(chǎn)，改善品質(zhì)的作用。筆者探討了四甲基戊二酸對菌絲和子座生長的影響規(guī)律，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，探究其對蛹蟲草生長的影響機(jī)理，確定最適添加量，為工廠化生產(chǎn)中提高蛹蟲草產(chǎn)量和品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試菌種由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供，菌株編號為CM-16。

1.1.2 培養(yǎng)基 主要有:

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉12 g，水1 000 mL(pH6.5～7.0)。

原種培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蔗糖10g，蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，檸檬酸鐵胺0.5 g，水1 000 mL(pH7.0)。

栽培原料：小麥。

栽培容器為：300 mm×200 mm×110 mm專用塑料盒。

1.1.3 植物生長調(diào)節(jié)劑 四甲基戊二酸(TGA)

1.2 方法

1.2.1 菌種制備 將蛹蟲草母種活化2次，轉(zhuǎn)接到母種平板培養(yǎng)基，菌絲體長滿后即為一級菌種。

將一級菌種定量轉(zhuǎn)接原種培養(yǎng)基，置于24℃、190 r/min震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，再定量轉(zhuǎn)接至原種液體培養(yǎng)基，按上述條件培養(yǎng)3d即為栽培用的液體菌種。

1.2.2 四甲基戊二酸對菌絲生長的作用 將TGA添加在母種培養(yǎng)基中制備得到試驗(yàn)用平板培養(yǎng)基，使其濃度分別為0，0.01，0.1，1，5，10和15 mg·L-1，各濃度水平重復(fù)5次。將直徑為9 mm的“菌餅”接種在平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件溫度約18℃、空氣濕度約65%，每隔3 d測量標(biāo)記并測量菌落直徑[7]。

1.2.3 四甲基戊二酸對子座生長發(fā)育的影響 TGA試驗(yàn)水平：分別為0，1，2，3，4和5 mg·L-1，其添加量以蛹蟲草栽培用水量(每盒450 mL)計(jì)算。

方法：按照常規(guī)熟料方法栽培，每盒添加風(fēng)干小麥300 g，不同濃度四甲基戊二酸水溶液450 mL，于121℃滅菌60 min，冷卻到25℃以下接種，每盒接種量40 mL。將接種后的栽培盒于溫度18～21℃、空氣相對濕度80%～90%、CO2體積分?jǐn)?shù)小于0.2%～0.3%的條件下黑暗培養(yǎng)6 d，從第7天開始每天光照8 h，光照強(qiáng)度400 lx，所有栽培盒均隨機(jī)擺放，定期調(diào)換擺放位置。

測定指標(biāo)：當(dāng)盒內(nèi)90%左右的子座頂部膨大時(shí)采收，測定子座長度、直徑、密度、鮮質(zhì)量，計(jì)算生產(chǎn)周期、基質(zhì)利用率等指標(biāo)。

基質(zhì)利用率=[(初始基質(zhì)風(fēng)干質(zhì)量-剩余基質(zhì)風(fēng)干質(zhì)量)/初始基質(zhì)風(fēng)干質(zhì)量]×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS和EXCEL圖表進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四甲基戊二酸對菌絲生長速率的影響

由圖1可見，當(dāng)TGA濃度為0～0.1 mg·L-1時(shí)，對菌絲生長速率的影響不大；當(dāng)TGA濃度為0.1～15 mg·L-1時(shí)，菌絲生長呈現(xiàn)先升后降趨勢，當(dāng)濃度為5 mg·L-1時(shí)菌絲生長最快，達(dá)到3.88 mm·d-1。表明不同濃度TGA對菌絲生長呈現(xiàn)出低促高抑的作用。

2.2 四甲基戊二酸對子座生長發(fā)育的影響

2.2.1 四甲基戊二酸濃度對子座分化時(shí)間的影響 由圖2可見，TGA能促進(jìn)子座提前分化，不同濃度對子座分化時(shí)間影響不同；TGA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，子座形成最早，比對照提前1.6 d。隨著濃度增高，分化時(shí)間逐漸延長，濃度為5 mg·L-1時(shí)子座形成最晚。

經(jīng)計(jì)算可得蛹蟲草子座分化時(shí)間(Y2)與TGA濃度(X2)之間的函數(shù)關(guān)系：

Y2=16.9816-1.5940/X2

(1)

對方程(1)進(jìn)行方差分析可得：F回歸=29.09>F0.01(1,4)=21.2，P=0.0057<0.01，表明該方程達(dá)到極顯著水平，此模型成立。

對方程(1)求極值得：

X(2)max=1.0(mg·L-1

Y(2)max=15.4(d)

即TGA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，蛹蟲草子座分化的最早為15.4 d。

2.2.2 四甲基戊二酸濃度對子座長度的影響 由圖3可見，隨著TGA添加濃度的提高，子座的長度迅速增加，過量的添加不利于子座的伸長

經(jīng)計(jì)算可得子座長度(Y3)與TGA濃度(X3)之間的函數(shù)關(guān)系：

Y3=-0.502X34+6.298X33+27.162X32+43.935X3+59.53

(3)

對方程(2)進(jìn)行方差分析可得：P=0.0395<0.05，表明該方程達(dá)到顯著水平。

對方程(2)求極值得：

X(3)max=1.35(mg·L-1)

Y(3)max=83.2(mm)

即TGA濃度為1.35 mg·L-1時(shí)，子座長度為83.2mm，達(dá)到最長。

2.2.3 四甲基戊二酸濃度對子座直徑的影響 經(jīng)計(jì)算得子座直徑(Y4)與TGA濃度(X4)的函數(shù)關(guān)系：

Y4=3.4757+0.878349/X4

(3)

對(3)式方差分析得：F回歸=20.077>F0.05(1,4)= 7.71，P=0.011<0.05，表明該方程達(dá)到顯著水平。

對方程(3)求極值得：

X(4)max=1.0(mg·L-1)

Y(4)max=4.35(mm)

即TGA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，子座直徑最大為4.35 mm。

由圖4可見， TGA濃度增加至1.0 mg·L-1時(shí)，子座直徑急劇增大，達(dá)到最高為4.35 mm；當(dāng)濃度大于1.0 mg·L-1，隨濃度升高子座直徑迅速減小，濃度在5 mg·L-1時(shí)子座最細(xì)；低濃度TGA能夠刺激子座橫向生長，而高濃度會抑制生長，使子座直徑纖細(xì)。

2.2.4 四甲基戊二酸濃度對子座密度的影響 由圖5可見,隨著TGA濃度的增加，子座密度雖先減小后增大，但整體變化不大。表明TGA對單位面積子座數(shù)量的影響不顯著。對4/5值進(jìn)行校正。原因是子座直徑增加后，密度必然減少。

2.2.5 四甲基戊二酸濃度對子座鮮質(zhì)量的影響 圖6經(jīng)計(jì)算可得子座鮮質(zhì)量(Y6)與TGA濃度(X6)之間的函數(shù)關(guān)系為：

y = 0.927x3- 10.31x2+ 24.28x + 231

(4)

對方程(4)進(jìn)行方差分析可得：F回歸=17.319>F0.05(2,3)=9.55，P=0.0551<0.05，表明該方程達(dá)到顯著水平，此模型成立。

對方程(4)求極值得：

X(4)max=1.47 (mg·L-1)

Y(4)max=247.35(g·盒-1)

即TGA濃度為1.47 mg·L-1時(shí)，蛹蟲草產(chǎn)量最高為每盒247.35 g。

從圖6可見，當(dāng)四甲基戊二酸濃度增加至1.47 mg·L-1時(shí)，子座鮮質(zhì)量迅速增加，達(dá)到最高為247.35 g·盒-1。當(dāng)濃度高于1.47 mg·L-1時(shí)，子座鮮質(zhì)量隨濃度的增加迅速降低，5 mg·L-1時(shí)降至最低，且低于對照組。

2.2.6 四甲基戊二酸濃度對生產(chǎn)周期的影響 由圖7經(jīng)計(jì)算可得生產(chǎn)周期(Y7)與TGA濃度(X7)之間的函數(shù)關(guān)系為：

Y7=-0.1306X73+1.1685X72-2.4593X7+47.612

(5)

對方程(5)進(jìn)行方差分析可得：F回歸=29.03>F0.05(2,3)=9.55，P=0.0335<0.05，表明該方程達(dá)到顯著水平，此模型成立。

對方程(5)求極值得：X(7)max=1.45(mg·L-1)，Y(7)max=46.1(d)

即TGA濃度為1.45 mg·L-1時(shí)，蛹蟲生產(chǎn)周期最短為46.1d。

由圖7可見，TGA濃度為1.45 mg·L-1時(shí)，生產(chǎn)周期最短為46.1 d，比對照縮短1.5 d。隨著添加濃度的繼續(xù)升高，生產(chǎn)周期逐漸延長。表明低濃度的TGA有利于子座發(fā)育成熟，提前采收期。

2.2.7 四甲基戊二酸濃度對基質(zhì)利用率的影響 由圖8經(jīng)計(jì)算可得基質(zhì)利用率(Y8)與TGA濃度(X8)之間的函數(shù)關(guān)系為：

Y8=X8/(-0.292436+0.434463X8)+35.3025

(6)

對方程(6)進(jìn)行方差分析可得：F回歸=40.5889>F0.01(2,3)= 30.81，P=0.0067<0.01，表明該方程達(dá)到極顯著水平，此模型成立。

對方程(6)求極值得：X(8)max=1.0(mg·L-1)Y(8)max=42(%)

即TGA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，蛹蟲草對基質(zhì)的利用最充分為42%。

由圖8可見，試驗(yàn)范圍內(nèi)基質(zhì)利用率均高于對照組。表明TGA能夠加快蛹蟲草對基質(zhì)營養(yǎng)的吸收利用；當(dāng)TGA濃度增加至1 mg·L-1時(shí)，基質(zhì)利用率迅速上升至最高為42%。這一濃度下子座鮮質(zhì)量也達(dá)到最高，表明此濃度下可以加快子座對基質(zhì)營養(yǎng)的吸收利用，提高子座產(chǎn)量。隨著濃度的繼續(xù)增加，蛹蟲草對基質(zhì)營養(yǎng)的吸收利用逐漸減弱。

3 結(jié)論與討論

3.1 四甲基戊二酸能夠促進(jìn)蛹蟲草菌絲生長

培養(yǎng)基中添加適量的四甲基戊二酸能夠起到增強(qiáng)細(xì)胞活力，刺激菌絲生長部位的敏感性，加快生長速率的作用，以5 mg·L-1濃度下促生長作用顯著高于其它濃度。濃度過低時(shí)對其它內(nèi)源激素的刺激作用弱，達(dá)不到顯著促生長作用，濃度過高時(shí)則會打破激素間的平衡，無法正常生長。

3.2 四甲基戊二酸能夠促進(jìn)蛹蟲草子座生長發(fā)育

不同濃度的四甲基戊二酸對蛹蟲草營養(yǎng)生長和生殖生長階段均有促進(jìn)作用。添加濃度在1～2 mg·L-1范圍時(shí)，四甲基戊二酸能夠作用于細(xì)胞，充當(dāng)內(nèi)源激素的作用，提高菌絲生長部位的敏感性，使菌絲生長加快，原基分化提早完成，子座采收提前。低濃度作用下細(xì)胞活力旺盛，生長代謝加快，對基質(zhì)營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)化更加充分，產(chǎn)量明顯提高。而高濃度對生長發(fā)育的促進(jìn)作用明顯減弱，甚至產(chǎn)生了抑制作用。

四甲基戊二酸能夠通過參與生物體內(nèi)的多種主要代謝過程，來實(shí)現(xiàn)改良品質(zhì)和增產(chǎn)的目的。固體栽培過程中子座長度、直徑、產(chǎn)量和基質(zhì)利用均呈現(xiàn)正相關(guān)，表明四甲基戊二酸低濃度作用下能夠使蛹蟲草細(xì)胞快速分裂、變大，子座粗壯。同時(shí)低濃度下能夠快速滲入細(xì)胞，提高細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)的流動，增強(qiáng)細(xì)胞活力，抗逆性增加，基質(zhì)中碳源和氮源等營養(yǎng)吸收更充分，提高了基質(zhì)的利用率，使生物量增加，產(chǎn)量提高。戊二酸濃度超出適宜的范圍后，破壞了蛹蟲草內(nèi)源激素間的平衡作用，且過高的濃度使細(xì)胞滲透壓加大，不利于原生質(zhì)的流動，細(xì)胞生長受到抑制，各項(xiàng)指標(biāo)均有所下降。

綜上所述，生產(chǎn)中可添加四甲基戊二酸濃度在1～2 mg·L-1范圍內(nèi)以提高蛹蟲草產(chǎn)量。以添加濃度為1.0 mg·L-1時(shí)蛹蟲草生長發(fā)育狀況為最佳。子座分化時(shí)間為15.4 d；子座長度83.2 mm；直徑達(dá)到4.35 mm；生產(chǎn)周期最短為46 d；基質(zhì)利用率為42%。