李海燕，鄒 蘭

(咸陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，陜西 咸陽 712034)

多胺(PAs)廣泛存在于生物細(xì)胞中，是生物代謝產(chǎn)生的一類有生物活性的脂肪族含氮堿，主要包括腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)[1]。PAs能夠提高作物對鹽害、干旱、冷害、低氧等環(huán)境脅迫的耐受性[2～3]。Tun在藥理學(xué)上的研究表明，PAs能誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生[4]。有研究證實，PAs和NO兩種信號物質(zhì)之間存在聯(lián)系，例如都參與了防御病原菌的反應(yīng)、響應(yīng)非生物脅迫及調(diào)節(jié)植物衰老等。本試驗以番茄幼苗為材料，通過測定NO、H2O2含量及NR、NOS活性，探討低溫脅迫下PAs與NO的關(guān)系，并為PAs誘導(dǎo)植物細(xì)胞合成一氧化氮提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗于2019年春季在西北農(nóng)林科技大學(xué)科研基地日光溫室中進(jìn)行。試驗番茄為“Moneymaker”。2019年3月15日播種，浸種催芽，選取發(fā)芽一致的種子播于穴盤，以草炭、蛭石、珍珠巖按2∶1∶1配基質(zhì)。4月10日分苗至10 cm×10 cm的塑料缽中，保持相同溫度和澆水量。在番茄五葉一心時，選取長勢相同的苗子放入人工氣候室，晝溫25℃，夜溫15℃。低溫處理溫度為4℃，設(shè)置4個處理，分別噴施1mmol Put、Spd、Spm 以及H2O(作為對照)，分別在0、12、24 h以及緩苗10 h(25℃下)取樣。

1.2 測定內(nèi)容與方法

1.2.1 NO含量的測定 稱取0.5 g番茄幼苗葉片，加入1 mL濃度為0.05 mol·L-1，pH=7.4，含有1%PVP的磷酸緩沖液，在冰上研磨成勻漿狀并轉(zhuǎn)移到離心管，再用1 mL緩沖液沖洗研磨壁，離心10 min(4℃，1 200 r·min-1)，取1mL上清液于1.5 mL離心管中備用，按照測試盒說明書來測定NO含量。

1.2.2 硝酸還原酶(NR)活性測定 采用活體法測定：稱取葉片0.5 g，加入試管中，對照先加入1 mL30%三氯乙酸溶液，然后再加入0.1 mol·L-11的KNO3溶液9 mL，抽氣1 h，置于25℃下暗反應(yīng)30 min，然后加入1 mL 30%三氯乙酸溶液，吸上清液1 mL于新試管中，加入2 mL 1%磺胺溶液和2 mL 0.02%萘胺溶液，顯色20 min，于540 nm下比色。

1.2.3 一氧化氮合酶(NOS)活性測定 NOS測定的磨樣方法與NO基本相同，勻漿離心20 min(0℃，15 000r·min-1)，為保護(hù)NOS活性應(yīng)盡快測量，或放入-20℃保存，按照NOS測試盒說明書測定含量。

1.2.4 H2O2含量的測定 H2O2測定參照Prochazkova等(2001)的方法[6]，稱取2 g番茄幼苗葉片冷凍樣，加8 mL預(yù)冷丙酮研磨，取1.0 mL研磨液與0.1 mL硫酸鈦及0.2 mL濃氨水混合，12 000×g離心10 min，用丙酮洗滌沉淀3次以上，用硫酸溶解后415 nm比色，后進(jìn)行0～20μmol·L-1H2O2—丙酮的標(biāo)樣測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 多胺對低溫脅迫下番茄幼苗葉片NO含量的影響

由圖1可見，低溫處理前各處理間NO含量基本相同；Put預(yù)處理后，與對照相比，NO含量均基本不變；Spd和Spm預(yù)處理后，低溫處理12 h和24 h時，NO含量高于對照且差異顯著，預(yù)處理后緩苗10h時NO含量與對照基本相同。由此可以看出，對于不同種類多胺，外源Spd和Spm預(yù)處理對低溫下番茄幼苗葉片NO含量有明顯影響，而Put預(yù)處理對低溫脅迫下NO含量無明顯影響。

2.2 多胺對低溫脅迫下番茄幼苗葉片NR活性的影響

由圖2可見，低溫處理前各處理間硝酸還原酶(NR)活性差異均不顯著；與對照相比，Put預(yù)處理后，低溫處理和緩苗后番茄幼苗葉片NR活性基本不變；Spd和Spm預(yù)處理后，低溫處理12 h和24 h時，NR活性高于對照且差異顯著，預(yù)處理后緩苗10 h時NR活性與對照基本相同。由此可以看出，對于不同種類多胺，外源Spd和Spm預(yù)處理對低溫脅迫下番茄幼苗葉片NR活性有影響，且Spm的效果更為明顯，而Put預(yù)處理對低溫脅迫下NR活性無明顯影響。

2.3 多胺對低溫脅迫下番茄幼苗葉片NOS活性的影響

由圖3可見，低溫處理前各處理間一氧化氮合酶(NOS)活性差異均不顯著；與對照相比，Put預(yù)處理后，低溫處理和緩苗后NOS活性基本維持不變；Spd和Spm預(yù)處理后，低溫處理12 h和24 h時，NOS活性明顯升高且差異顯著，預(yù)處理后緩苗10h時NOS活性與對照基本相同。由此可以看出，對于不同種類多胺，外源Spd和Spm預(yù)處理對低溫脅迫下番茄幼苗葉片NOS活性有顯著影響，而Put預(yù)處理對低溫脅迫下NOS活性無明顯影響。

2.4 多胺對低溫脅迫下番茄幼苗葉片H2O2活性的影響

由圖4可見，低溫處理前各處理間H2O2含量差異均不顯著；與對照相比，Put預(yù)處理后，低溫處理和緩苗后H2O2含量基本維持不變；Spd和Spm預(yù)處理后，低溫處理12 h和24 h時，番茄幼苗葉片H2O2含量明顯升高且差異顯著，預(yù)處理后緩苗10 h時H2O2含量與對照基本相同。由此可以看出，對于不同種類多胺，外源Spd和Spm預(yù)處理對低溫脅迫下番茄幼苗葉片H2O2含量有明顯影響，且Spm的效果更加明顯，而Put預(yù)處理對低溫脅迫下H2O2含量無明顯影響。

2.5 CAT預(yù)處理下多胺對番茄幼苗葉片NO含量的影響

由圖5A可見，外源添加過氧化氫酶(CAT)作為過氧化氫清除劑對番茄幼苗進(jìn)行預(yù)處理24 h，然后噴施Spd，低溫處理12 h和24 h時，NO含量比未進(jìn)行CAT預(yù)處理顯著降低，噴施Spm能達(dá)到相同的效果(圖5B)，噴施Put時NO含量差異不顯著(圖5C)。由此可以看出，在低溫脅迫下，CAT對番茄幼苗葉片NO產(chǎn)生了抑制作用，而CAT是植物體內(nèi)H2O2的清除酶，因此可以推斷出，多胺誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生與H2O2有著某種關(guān)聯(lián)，當(dāng)H2O2的產(chǎn)生受到抑制時，會影響植物體內(nèi)NO的含量，所以H2O2可能作為上游信號物質(zhì)來影響NO含量。

3 討論

PAs作為第二信使參與植物的逆境脅迫響應(yīng)。NO也是植物對抗一些生物和非生物逆境脅迫防御反應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵信號分子參與植物體內(nèi)多種生理代謝，包括促進(jìn)生長、延緩衰老、促進(jìn)種子萌發(fā)、誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和防御相關(guān)基因表達(dá)[7～8]。Tun等人研究表明，PAs能誘導(dǎo)產(chǎn)生NO。筆者試驗結(jié)果表明，與CK相比，低溫脅迫下Spd和Spm處理顯著增加了番茄幼苗葉片NO的含量，而Put處理的效果不明顯，進(jìn)一步證實了PAs能誘導(dǎo)產(chǎn)生NO 的說法。

植物體有酶催化和非酶催化二種途徑合成NO。有氧條件下主要靠NR途徑合成NO，NADH把電子傳給NO2-，還原產(chǎn)生NO。正常條件下，植物體內(nèi)含很少NO2-，研究顯示，植物在缺光或缺氧下會產(chǎn)生大量NO2-。植物正常生長時，細(xì)胞中NO含量較低，在遇到逆境時，NO2-會被還原成NO，這可能是植物在逆境脅迫下產(chǎn)生NO的原因[9]。試驗結(jié)果也表明了，低溫脅迫下，Spd和Spm處理會顯著增加番茄幼苗葉片NR和NOS的活性，而Put處理沒有明顯效果，這進(jìn)一步可以證明多胺能誘導(dǎo)產(chǎn)生NO。

研究表明，H2O2可以作為重要的信號分子參與植物一些生理活動的調(diào)控，并與其他一些信號分子之間有著密切關(guān)系。H2O2產(chǎn)生可能處于NO合成的上游，研究表明NO的合成依賴于H2O2的產(chǎn)生[10]。也就是說H2O2可促進(jìn)NO的合成，同時一定濃度下的NO又能提高H2O2的水平，兩者之間有著密切關(guān)系。本試驗結(jié)果表明，低溫脅迫下，Spd和Spm顯著提高了番茄幼苗葉片H2O2的水平，從而進(jìn)一步提高了NO的水平。試驗結(jié)果還表明，外源添加過氧化氫清除劑(CAT)后，Spd和Spm處理過的番茄幼苗葉片NO含量顯著下降，這為H2O2可以提高NO的水平的猜想提供了有力證據(jù)。

4 結(jié)論

低溫脅迫下，多胺能夠誘導(dǎo)NO的合成，基本途徑有三個，通過NR和NOS的酶催化途徑生成NO，以及通過H2O2作為信號分子誘導(dǎo)產(chǎn)生NO。

(1)逆境脅迫下，Spd和Spm能夠誘導(dǎo)NO的合成，而Put作用不明顯。

(2)逆境脅迫下，Spd和Spm處理會顯著增加番茄幼苗葉片NR和NOS的活性，而Put處理沒有明顯效果，說明多胺誘導(dǎo)下植物體可以通過NR和NOS酶催化途徑來合成NO。

(3)逆境脅迫下，Spd和Spm處理時植物體中H2O2含量顯著升高，外源添加過氧化氫清除劑(CAT)后，Spd和Spm處理的番茄幼苗葉片NO含量顯著下降，H2O2可以作為重要的信號分子來誘導(dǎo)NO的合成。