孫少雙　王冬雪　楊秀玲　周雪平

摘要 雙生病毒是一類在全球范圍內(nèi)危害嚴(yán)重的單鏈環(huán)狀DNA病毒。本研究從2017年采自云南的勝紅薊樣品中（YN2017）獲得了一條菜豆金色花葉病毒屬病毒和一條β衛(wèi)星的全基因組序列。該雙生病毒的全長序列與煙草曲莖病毒的相似性最高，為99.60%，確定為煙草曲莖病毒的分離物。YN2017 β衛(wèi)星與中國勝紅薊黃脈β衛(wèi)星的同源性最高，為90.8%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該β衛(wèi)星的衛(wèi)星保守區(qū)域（SCR）至富含腺嘌呤區(qū)（A-rich區(qū)）之間約1 kb的序列與中國勝紅薊黃脈β衛(wèi)星相應(yīng)序列的相似性高達(dá)97.2%;其包含的A-rich區(qū)上游與SCR之間約300 bp的序列與中國勝紅薊黃脈β衛(wèi)星相應(yīng)序列的相似性僅為70.2%，而與煙草曲莖β衛(wèi)星相應(yīng)序列的相似性最高，為97.3%。重組分析發(fā)現(xiàn)，所分離的β衛(wèi)星是由中國勝紅薊黃脈β衛(wèi)星和煙草曲莖β衛(wèi)星重組產(chǎn)生。這是首次在中國發(fā)現(xiàn)由不同的β衛(wèi)星重組產(chǎn)生的β衛(wèi)星分子。

關(guān)鍵詞 勝紅薊; 雙生病毒; β衛(wèi)星; 重組

中圖分類號：

S 432.41

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019253

Identification of a recombinant geminivirus-associated betasatellite from Ageratum conyzoides

SUN Shaoshuang， WANG Dongxue， YANG Xiuling*， ZHOU Xueping

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Geminiviruses are a group of single-stranded DNA viruses that cause severe losses to many crops worldwide. In this study， we determined the complete nucleotide sequences of a begomovirus and a betasatellite from an Ageratum conyzoides plant （YN2017） showing yellow vein and leaf curling symptoms in Yunnan. The begomovirus shared 99.60% sequence identity with Tobacco curly shoot virus （TbCSV）and thus was identified as an isolate of TbCSV. The YN2017 betasatellite shared the highest sequence identity （90.8%） with Ageratum yellow vein China betasatellite （AYVCNB）. Further analysis of the betasatellite sequences showed that the sequences from the satellite conserved region （SCR） to the A-rich region shared 97.2%identity with the homologous sequences of AYVCNB， while the sequences between the SCR and the upstream A-rich region only shared 70.2%identity with that of AYVCNB. Instead， these sequences were more closely related （97.3%sequence identity） to the coordinated sequences of TbCSB. Recombination detection analysis showed that the betasatellite might result from the recombination of AYVCNB and TbCSB. This is the first report of a recombinant betasatellite that has arisen from betasatellites recombination in China.

Key words

Ageratum conyzoides; geminivirus; betasatellite; recombination

雙生病毒是一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA病毒，病毒粒子大小為18 nm×30 nm?；诨蚪M結(jié)構(gòu)、介體種類和寄主范圍，2017年國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV）將雙生病毒科分為9個屬和2個暫定種，分別為玉米線條病毒屬M(fèi)astrevirus、菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus、甜菜曲頂病毒屬Curtovirus、番茄偽曲頂病毒屬Topocuvirus、美杜莎潛隱病毒屬Capulavirus、畫眉草條紋病毒屬Eragrovirus、伊朗甜菜曲頂病毒屬Becurtovirus、蕪菁曲頂病毒屬Turncurtovirus和葡萄紅色斑點病毒屬Grablovirus以及桑花葉型矮縮相關(guān)病毒和柑橘褪綠矮縮病毒[1]。其中，種類最多、造成危害最嚴(yán)重的是由煙粉虱以持久性方式傳播的菜豆金色花葉病毒屬病毒。

菜豆金色花葉病毒屬病毒的基因組既有單組分，也有雙組分。其中，雙組分雙生病毒的基因組含有大小約為2.5～2.6 kb的DNA-A和DNA-B兩個組分，單組分的雙生病毒僅含有一個在大小和結(jié)構(gòu)上與雙組分病毒的DNA-A組分類似的DNA組分[2]。很多單組分的雙生病毒都伴隨有一類衛(wèi)星DNA分子，大小約為1.3 kb，稱為β衛(wèi)星（betasatellite）。雖然β衛(wèi)星依賴輔助病毒進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和裝配，但是β衛(wèi)星是一個多功能的DNA分子，能夠逃脫RNA沉默等植物防御反應(yīng)，并且是勝紅薊黃脈病毒Ageratum yellow vein virus（AYVV）、木爾坦棉花曲葉病毒Cotton leaf curl Multan virus等多種菜豆金色花葉病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生典型的病害癥狀所必需的[3-5]。自1999年從感染AYVV的勝紅薊樣品中首次分離鑒定出β衛(wèi)星以來[6]，目前已鑒定的β衛(wèi)星的全長序列多達(dá)1 300多條。由于β衛(wèi)星的種類較多，2017年ICTV將其劃分為番茄曲葉病毒衛(wèi)星科Tolecusatellitidae β衛(wèi)星屬Betasatellite，包含了61個種（http：∥talk.ictvonline.org/taxonomy）。β衛(wèi)星與其輔助病毒組成的病害復(fù)合體廣泛分布于全球37個國家和地區(qū)，對棉花、番茄、番木瓜等多種作物造成了毀滅性危害[4]。

雜草因其分布廣泛、生存能力強(qiáng)，是多種雙生病毒的中間寄主和初侵染源，在雙生病毒的病害流行中具有重要作用[7-8]。勝紅薊Ageratum conyzoides L.，又稱白華草，為菊科藿香薊屬一年生草本植物，主要分布在我國福建、云南、廣東和貴州等地，具有清熱解毒、止血止痛的功效。目前已有報道發(fā)現(xiàn)勝紅薊是多種雙生病毒，如AYVV、中國勝紅薊黃脈病毒Ageratum yellow vein China virus、煙草曲莖病毒Tobacco curly shoot virus（TbCSV）和番木瓜曲葉病毒Papaya leaf curl virus的寄主[6， 9-12]。本研究從云南采集了表現(xiàn)曲葉和黃脈癥狀的勝紅薊樣品，從中分離到了TbCSV，并首次從中國分離到由不同的β衛(wèi)星重組產(chǎn)生的β衛(wèi)星分子。

1 材料與方法

1.1 病害樣品的采集

2017年8月從云南省采集了勝紅薊病株（YN2017），該病株具有明顯的黃脈和葉片卷曲等疑似雙生病毒侵染的癥狀（圖1）。

1.2 植物總DNA的提取及PCR檢測

利用CTAB法提取勝紅薊病株YN2017的葉片總DNA[13]。以提取的總DNA為模板，利用雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬病毒的簡并引物PA/PB（PA： 5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′;PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′）進(jìn)行PCR檢測。該引物擴(kuò)增的目的片段約500 bp，擴(kuò)增區(qū)域包含該屬病毒的基因間隔區(qū)及外殼蛋白保守區(qū)。同時，利用β衛(wèi)星的通用引物β01/β02（β01：5′-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3′;β02：5′-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3′）擴(kuò)增雙生病毒β衛(wèi)星的全長序列（約1.3 kb）。PCR反應(yīng)體系為：2×TransStart FastPfu DNA Polymerase mix（北京全式金生物公司） 10 μL、20 μmol/L的上、下游引物各0.2 μL、植物總DNA 200 ng，加超純水補(bǔ)齊至20 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min;95℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s（PA/PB引物）或1 min（β01/β02引物），循環(huán)35次;72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。在紫外燈下割取目的片段，利用Omega DNA凝膠回收試劑盒分離純化目的片段，將回收產(chǎn)物與pEASY-blunt cloning vector（全式金生物公司）連接，通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布于含有卡那霉素的LB固體平板上，在37℃條件下倒置培養(yǎng)過夜，菌落PCR鑒定后挑取陽性克隆送至擎科生物測序公司測序。

1.3 病毒DNA-A全長基因組的克隆

在測序獲得的500 bp片段的DNA-A序列基礎(chǔ)上，設(shè)計擴(kuò)增病毒DNA-A全長的特異引物（A-F：5′-GTCGAAGCGTCCAGCAGATA-3′;A-R：5′-AGCGGGCGTGGAAATGATTA-3′）對勝紅薊樣品中的DNA-A全長進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系參考1.2，PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2 min;95℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次;72℃延伸10 min。按1.2中的方法進(jìn)行克隆測序。

1.4 病毒DNA-A及其β衛(wèi)星的基因組結(jié)構(gòu)和進(jìn)化重組分析

利用DNASTAR Lasergene 7軟件中的EditSeq和SeqMan對所測定的DNA-A和β衛(wèi)星的序列進(jìn)行處理和全長拼接;利用NCBI中的BLAST進(jìn)行比對分析，尋找同源關(guān)系較近的序列;用SnapGene軟件構(gòu)建β衛(wèi)星的基因組結(jié)構(gòu);利用MEGA 7.0軟件的鄰近相連法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，步差值設(shè)置為1 000;利用RDP 4.97軟件對序列進(jìn)行重組分析，參數(shù)設(shè)置為：讀寬30 nts，置信概率0.000 1，所測重組序列之間需要有50%～100%的序列相似性[14]。

1.5 重組β衛(wèi)星親本序列的檢測

以YN2017樣品中的DNA為模板，分別采用AYVCNB的特異引物（AYVCNVB-F：5′-CCATCTCATATTTACGAAGTC-3′;AYVCNVB-R：5′-GCCCACCTCCGTGTTGGTACT-3′），以及TbCSB的特異引物（TbCSB-F：5′-GTCTACACAGTACTACGTTGA-3′;TbCSB-R：5′-ACCCTCCCAGGGGTACACAAC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒DNA-A的基因組擴(kuò)增及結(jié)構(gòu)分析

以勝紅薊病株YN2017的總DNA為模板，利用引物PA/PB從樣品中可以擴(kuò)增得到約500 bp的目的片段。將測序得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆的片段與TbCSV的外殼蛋白的相似性高達(dá)99%，表明該樣品可能感染了雙生病毒。進(jìn)一步根據(jù)測序得到的序列設(shè)計擴(kuò)增病毒全長的特異引物A-F和A-R，從勝紅薊樣品中擴(kuò)增得到大約2.8 kb的特異片段。將目的片段克隆測序，并且進(jìn)行序列拼接后得到的DNA-A全長序列為2 746 bp（GenBank登錄號：MK948360）。序列分析發(fā)現(xiàn)，所獲得的DNA-A具有菜豆金色花葉病毒屬病毒典型的基因組結(jié)構(gòu)，共編碼了6個開放閱讀框（open reading frames， ORFs），其中病毒鏈編碼了AV1（294-1 064 nt）和AV2（134-481 nt），互補(bǔ)鏈編碼了AC1（1 513-2 598 nt）、AC2（1 206-1 610 nt）、AC3（1 061-1 465 nt）和AC4（2 148-2 570 nt），AC1和AV2之間含有一個283 nt的基因間隔區(qū)（intergenic region， IR）。IR區(qū)中具有一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包含了病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始所需的9堿基保守序列TAATATTAC。

2.2 病毒DNA-A的進(jìn)化和重組分析

利用NCBI的BLAST將YN2017分離物DNA-A的全長基因組序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其與TbCSV-[Y282]（AJ971266.1）的全長序列相似性最高，為99.60%。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)TbCSV-[YN2017]與TbCSV的云南分離物TbCSV-[Y282]（AJ971266.1）和TbCSV-[Y35]（AJ420318.1）的親緣關(guān)系最近（圖2）。根據(jù)ICTV制定的雙生病毒種的分類標(biāo)準(zhǔn)，TbCSV-[YN2017]為TbCSV的一個分離物。RDP重組分析表明，TbCSV-[YN2017]并無重組事件發(fā)生。

2.3 β衛(wèi)星的基因組擴(kuò)增及結(jié)構(gòu)分析

很多單組分的菜豆金色花葉病毒都伴隨有β衛(wèi)星分子，β衛(wèi)星與其輔助病毒形成的病害復(fù)合體給農(nóng)作物生產(chǎn)造成了巨大危害。前期研究表明，有些TbCSV的分離物伴隨有β衛(wèi)星，有些分離物不含有β衛(wèi)星分子[15]。為了明確采集的YN2017樣品中是否伴隨有β衛(wèi)星分子，利用雙生病毒β衛(wèi)星的通用引物β01/β02從樣品中擴(kuò)增得到了約1.3 kb左右的目的片段。將片段回收后進(jìn)行克隆測序，序列拼接后得到1 335 bp的全長序列（GenBank登錄號：MK948361）。對其基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該β衛(wèi)星具有典型的β衛(wèi)星的結(jié)構(gòu)，主要包括三個特征：1） 含有一個大小約120 bp的衛(wèi)星保守區(qū)（satellite conserved region， SCR）。SCR區(qū)含有保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和9堿基核苷酸序列TAATATTAC;2） 互補(bǔ)鏈上編碼一個大小約為13 kD的βC1蛋白;3） βC1上游還含有一個腺嘌呤富含區(qū)（A-rich region），表明YN2017分離物伴隨有β衛(wèi)星分子。

2.4 β衛(wèi)星的進(jìn)化和重組分析

利用BLAST對YN2017樣品中的β衛(wèi)星的全長基因組序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該β衛(wèi)星與中國勝紅薊黃脈β衛(wèi)星Ageratum yellow vein China betasatellite（AYVCNB）海南分離物AYVCNB-[Hn9]（AM048835.1）和AYVCNB-[Hn2]（AM048834.1）的相似性最高，均為90.8%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，YN2017 β衛(wèi)星的1-979 nt和1 282-1 335 nt的序列與AYVCNB-[Hn9]相應(yīng)序列的相似性高達(dá)97.2%;980-1 281 nt的序列與AYVCNB-[Hn9]相應(yīng)序列的相似性僅為70.2%，而與煙草曲莖β衛(wèi)星TbCSB-[Y35]（AJ421484.1）相應(yīng)序列的相似性高達(dá)97.3%，暗示著YN2017 β衛(wèi)星可能是由重組產(chǎn)生的。利用RDP軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)YN2017 β衛(wèi)星是由AYVCNB和TbCSB重組產(chǎn)生的一個β衛(wèi)星分子，AYVCNB為主要親本，TbCSB為次要親本，重組的位點主要包括A-rich上游以及SCR之間的區(qū)域，重組的置信概率為2.676×10-33（圖3）?；讦滦l(wèi)星的全基因組序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)YN2017樣品中的β衛(wèi)星在進(jìn)化樹上單獨聚為一支（圖4）。

為了明確YN2017樣品中是否存在重組β衛(wèi)星的親本，結(jié)合YN2017 β衛(wèi)星、AYVCNB和TbCSB的序列設(shè)計了檢測AYVCNB和TbCSB的特異引物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用AYVCNB-F和AYVCNB-R以及TbCSB-F和TbCSB-R均檢測不到目的條帶，但是利用AYVCNB-F和TbCSB-R能夠檢測到約1.3 kb的條帶，回收該片段并且進(jìn)行克隆測序后，發(fā)現(xiàn)AYVCNB-F和TbCSB-R所擴(kuò)增的條帶確實為重組的β衛(wèi)星分子。

3 結(jié)論與討論

近年來，雙生病毒在全國范圍內(nèi)的危害日益嚴(yán)重，給作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅[16]。雜草是雙生病毒重要的原始寄主或中間寄主，在雙生病毒的侵染循環(huán)和病毒的暴發(fā)流行中具有重要作用。我們于2017年8月從云南采集了一份疑似感染雙生病毒的勝紅薊樣品，染病的勝紅薊葉片出現(xiàn)葉脈黃化、曲葉等癥狀。通過分子克隆以及序列分析，我們發(fā)現(xiàn)該樣品中病毒DNA-A的全長序列與TbCSV-[SC118]的相似性最高，為TbCSV的一個分離物。我們還發(fā)現(xiàn)該樣品中伴隨有β衛(wèi)星，且該β衛(wèi)星是由AYVCNB和TbCSB重組產(chǎn)生。這是在我國首次發(fā)現(xiàn)雙生病毒不同的β衛(wèi)星之間可以發(fā)生重組產(chǎn)生新的β衛(wèi)星分子。

Li等[15]對采自云南的番茄樣品的病原進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與TbCSV伴隨的衛(wèi)星為TbSCB。Jiao等[12]對2010年采自云南的勝紅薊樣品的病原進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)侵染云南勝紅薊的病毒是TbCSV，伴隨的衛(wèi)星為AYVCNB。由于所鑒定的YN2017 β衛(wèi)星是由AYVCNB和TbCSB重組產(chǎn)生，我們利用AYVCNB和TbCSB的特異引物去檢測所采集的YN2017樣品中是否存在重組β衛(wèi)星的親本序列，結(jié)果均檢測不到AYVCNB和TbCSB;而將AYVCNB和TbCSB的特異引物進(jìn)行交叉組合時能檢測到重組β衛(wèi)星。雙生病毒除了以滾環(huán)擴(kuò)增的方式在寄主植物的細(xì)胞核中進(jìn)行復(fù)制外，還能夠以依賴于重組的方式進(jìn)行復(fù)制。我們推測可能是由于AYVCNB和TbCSB的復(fù)合侵染增加了病毒基因組重組的概率，導(dǎo)致了重組β衛(wèi)星分子的產(chǎn)生。由于雙生病毒對β衛(wèi)星的復(fù)制具有復(fù)制選擇性[17-19]，在長期的進(jìn)化過程中TbCSV可能更傾向于復(fù)制和維持重組的β衛(wèi)星。

重組是驅(qū)動雙生病毒種群間遺傳多樣性和形成新種群的重要機(jī)制。重組產(chǎn)生的新病毒或株系往往具有更強(qiáng)的致病性，導(dǎo)致新的病毒或株系的形成，引起病毒病的大流行。其中一個典型的例子就是非洲木薯花葉病毒African cassava mosaic virus （ACMV）和東非木薯花葉病毒East African cassava mosaic virus（EACMV）重組后產(chǎn)生新病毒株系EACMV-[UgV]，重組病毒與ACMV復(fù)合侵染引起烏干達(dá)木薯花葉病的大流行，導(dǎo)致該國木薯毀滅性死亡[20]。目前已有多項研究表明，雙生病毒的重組經(jīng)常發(fā)生在同科不同屬的病毒之間，也可以發(fā)生在同屬不同種的病毒之間，或者發(fā)生在β衛(wèi)星和輔助病毒之間，但是關(guān)于不同β衛(wèi)星重組產(chǎn)生的β衛(wèi)星的報道較少。2009年Mubin等[21]從巴基斯坦的棉花產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)黃脈和曲葉癥狀的單年生雜草中首次鑒定到一種由不同的β衛(wèi)星重組產(chǎn)生的重組β衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)該重組β衛(wèi)星是由煙草曲葉β衛(wèi)星和木爾坦棉花曲葉β衛(wèi)星重組產(chǎn)生;而我們的研究也是從雜草中鑒定到重組β衛(wèi)星，表明雜草不僅可以作為雙生病毒的初侵染源或中間寄主，而且容易使雙生病毒發(fā)生重組產(chǎn)生新的病毒種類。因此需進(jìn)一步加強(qiáng)對雜草上的病毒開展系統(tǒng)調(diào)查和檢測，并在雙生病毒病的防治過程中及時徹底清除田間雜草。

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（責(zé)任編輯：田 喆）