楊大明，李永鵬

（酒鋼集團祁牧乳業(yè)有限責任公司，甘肅 嘉峪關 735100）

1 概述

褐色酸奶是近兩年興起的酸奶品類，其核心技術主要是長時間高溫熱處理，使得牛奶中的還原糖與蛋白質之間發(fā)生美拉德反應（Maillard reaction），再經發(fā)酵制成褐色并伴有焦甜風味的酸奶[1-2]。Arena等[3]指出乳制品中的美拉德反應產物是許多生物活性肽的來源，也是重要的風味物質，但乳品中的美拉德反應同樣會產生晚期糖基化終產物（Advanced glycation end products，AGEs），這將不利于健康。 然而，Oh等[4]研究發(fā)現(xiàn)，褐色酸奶則能夠抑制心血管疾病，前提是控制好美拉德反應與發(fā)酵的程度。此外，張俊山[5]以及白雪等[6]都研究了褐色酸奶的工藝優(yōu)化，這些學者均采用了正交設計進行的工藝優(yōu)化，并且發(fā)現(xiàn)褐色酸奶的褐變程度及發(fā)酵程度顯著影響最終產品的感官評分水平。韓千慧等[7]則系統(tǒng)地研究了褐色酸奶的品質評價方法，并指出褐色酸奶是品質特征完全不同于普通酸奶的產品類型，因此其發(fā)酵工藝不能套用普通酸奶的現(xiàn)成工藝參數(shù)。劉婕等[8]將傳統(tǒng)希臘酸奶改造為褐色酸奶，發(fā)現(xiàn)感官評價得分最高的工藝參數(shù)并不同于傳統(tǒng)工藝。根據(jù)相關研究，新型酸奶在某些通用工藝方面有必要調節(jié)具體參數(shù)[9-15]。綜上所述，傳統(tǒng)酸奶制作工藝在向著褐色酸奶轉化時，原有工藝條件并不一定適用，因而需要轉化調節(jié)，這就需要進行生產工藝的優(yōu)化設計。

甘肅祁牧乳業(yè)也于2016年底，開始引入凝固型褐色酸奶產品，并在2017年在初步工藝優(yōu)化的基礎上將該類產品開發(fā)成了攪拌型褐色酸奶，然而初級產品的口感及質地等品質尚有提高的空間。然而，由于受到原有實驗室條件的限制，該工藝優(yōu)化調整一直缺乏足夠的基礎。隨著祁牧乳業(yè)研發(fā)團隊的成立，相關硬件軟件設施的完善，尤其是感官評價小組培訓的完成，祁牧乳業(yè)研發(fā)團隊逐漸具備了這樣的工藝優(yōu)化研究條件。因此，本文采用單因素和響應面設計結合的方式，以感官評價得分為依據(jù)，對攪拌型褐色酸奶的生產工藝進行了優(yōu)化，從而形成最優(yōu)工藝，以期為高品質產品生產提供理論及技術方案的依據(jù)。

2 試驗材料和試驗方法

2.1 試驗原料

鮮牛奶，甘肅祁牧乳業(yè)有限責任公司；穩(wěn)定劑（S-01型、DN-201 型、HBA-2L-5 型）， 河北百優(yōu)生物科技有限公司；乳清蛋白粉（WPC-80），江蘇普新生物科技有限公司；加糖煉乳；稀奶油；YO-MIX883型發(fā)酵劑，丹尼斯克（中國）有限公司。

2.2 試驗設備

SW-CJ-ID型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；EMS-30型磁力攪拌水浴鍋，常州市人和儀器廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療機械廠；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；GJJ-0.5/25高壓均質機，上海諾尼輕工機械有限公司。

2.3 工藝流程及關鍵控制參數(shù)分析

2.3.1 褐色酸奶工藝流程

原奶→標準化→添加輔料（穩(wěn)定劑）→預熱、均質→殺菌→褐變→配料 （蔗糖與葡萄糖）→殺菌→接種→發(fā)酵→攪拌破乳→灌裝→檢驗→冷卻后熟→成品。

2.3.2 品質關鍵控制參數(shù)分析

1）蔗糖與葡萄糖比例：蔗糖主要貢獻于產品的甜度，葡萄糖則是乳酸菌發(fā)酵利用的最主要的來源，兩者只有達到一個平衡時，才能保證最終產品發(fā)酵程度和甜味之間形成最佳的甜酸比例，達到最佳口感。

2）總糖添加量：加糖不足則甜味和發(fā)酵程度達不到要求，加糖量過多則會引起過甜的感覺，因此總糖添加量必須控制在適當水平。

3）穩(wěn)定劑種類：目前祁牧乳業(yè)供貨商主要提供3種現(xiàn)成的穩(wěn)定劑，根據(jù)已經形成的標準化生產模塊，其添加量均為0.5%，其具體型號分別為S-01型、DN-201型、HBA-2L-5型，究竟哪一種更適用于褐色酸奶還有待進一步研究。

4）褐變溫度：美拉德反應只有在溫度達到一定程度后才可能發(fā)生，而且溫度對于產物的影響很大，因此最佳風味物質的產生于溫度范圍密切相關。

5）褐變時間：根據(jù)研究，美拉德反應產物的累積直接相關于反應時間，鏈式反應的終端產物不但風味較差，而且不利于健康[3]，因此適宜的反應時間對于良好風味的形成關系密切。

6）發(fā)酵溫度：發(fā)酵溫度要適合微生物最適宜的生長溫度，過熱或過冷均會產生應激反應而產生不良風味。

7）發(fā)酵時間：發(fā)酵時間決定了最終產品的酸度以及黏稠度，是影響產品的關鍵因素。

8）冷卻后熟時間：由于受生產條件的限制，后熟的溫度只能采用與常規(guī)冷庫一致的4℃，冷卻時間就成為了影響后熟風味形成的關鍵因素。

2.4 試驗設計

2.4.1 單因素實驗設計

通過分析，祁牧乳業(yè)可供改進的攪拌型褐色酸奶品質關鍵控制點共有8個，這8個關鍵控制點的暫定工藝參數(shù)為：蔗糖與葡萄糖比例5:5，總糖添加量6%，穩(wěn)定劑為HBA-2L-5型，褐變溫度92℃，褐變時間270min，發(fā)酵溫度 42℃，發(fā)酵時間 8h，冷卻后熟時間為24h。其他工藝參數(shù)為現(xiàn)有標準化生產條件，具體包括殺菌溫度85℃、殺菌時間15s、接種量0.025%、配料溫度65℃、穩(wěn)定劑添加量0.5%、乳清蛋白粉添加量0.5%、稀奶油添加量0.5%，攪拌破乳速度10r/min，不具備調整的可能性。針對上述7個可調控的關鍵控制參數(shù)進行單因素實驗設計（重復數(shù)n=3），以感官評價為依據(jù)，選擇最佳工藝點。

1）蔗糖與葡萄糖比例：蔗糖與葡萄糖的總糖添加量選擇為6%，穩(wěn)定劑選擇HBA-2L-5型，褐變溫度控制為92℃，褐變時間控制為210min，發(fā)酵溫度控制為42℃，發(fā)酵時間控制為8h，冷卻后熟時間為24h。蔗糖與葡萄糖比例則分別選擇 2:8、4:6、5:5、6:4、8:2。制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定最佳比例。

2）總糖添加量：蔗糖與葡萄糖比例選擇為5:5，穩(wěn)定劑選擇HBA-2L-5型，褐變溫度控制為92℃，褐變時間控制為210min，發(fā)酵溫度控制為42℃，發(fā)酵時間控制為8h，冷卻后熟時間為24h?？偺翘砑恿糠謩e選擇4%、6%、8%、10%、12%。制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定總糖添加量。

3）穩(wěn)定劑種類：蔗糖與葡萄糖比例選擇為5:5，總糖添加量選擇6%，褐變溫度控制為92℃，褐變時間控制為210min，發(fā)酵溫度控制為42℃，發(fā)酵時間控制為8h，冷卻后熟時間為24h。穩(wěn)定劑分別選擇S-01型、DN-201型、HBA-2L-5型。制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定穩(wěn)定劑種類。

4）褐變溫度：蔗糖與葡萄糖比例選擇為5:5，總糖添加量選擇6%，穩(wěn)定劑選擇HBA-2L-5型，褐變時間控制為210min，發(fā)酵溫度控制為42℃，發(fā)酵時間控制為8h，冷卻后熟時間為24h，褐變溫度分別控制為 91℃、92℃、93℃、94℃、95℃。 制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定褐變溫度。

5）褐變時間：蔗糖與葡萄糖比例選擇為5:5，總糖添加量選擇6%，穩(wěn)定劑選擇HBA-2L-5型，褐變溫度控制為92℃，發(fā)酵溫度控制為42℃，發(fā)酵時間控制為8h，冷卻后熟時間為24h，褐變時間分別控制為 120min、180min、210min、240min、270min。 制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定褐變時間。

6）發(fā)酵溫度：蔗糖與葡萄糖比例選擇為5:5，總糖添加量選擇6%，穩(wěn)定劑選擇HBA-2L-5型，褐變溫度控制為92℃，褐變時間控制為210min，發(fā)酵時間控制為8h，冷卻后熟時間為24h，發(fā)酵溫度分別控制為 40℃、41℃、42℃、43℃、44℃。制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定發(fā)酵溫度。

7）發(fā)酵時間：蔗糖與葡萄糖比例選擇為5:5，總糖添加量選擇6%，穩(wěn)定劑選擇HBA-2L-5型，褐變溫度控制為92℃，褐變時間控制為210min，發(fā)酵溫度控制為42℃，冷卻后熟時間為24h，發(fā)酵時間分別控制為 7h、8h、9h、10h、11h。 制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定發(fā)酵時間。

8）冷卻后熟時間：蔗糖與葡萄糖比例選擇為5:5，總糖添加量選擇6%，穩(wěn)定劑選擇HBA-2L-5型，褐變溫度控制為92℃，褐變時間控制為210min，發(fā)酵溫度控制為42℃，發(fā)酵時間分別控制為8h，冷卻后熟時間分別控制為 24h、48h、72h、96h， 制成成品以后根據(jù)感官評價結果確定冷卻后熟時間。

2.4.2 工藝參數(shù)的Box-Behnken響應面優(yōu)化

從上述7個工藝參數(shù)中篩選出可變動的3～4個工藝參數(shù)，進行Box-Behnken響應面優(yōu)化設計，篩選結果根據(jù)單因素試驗結果而定。根據(jù)單因素實驗結果，選取褐變時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為響應面優(yōu)化的3個因素，其因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應面優(yōu)化設計因素水平表

2.5 感官評價得分

感官評分依據(jù)劉婕等采用的方法進行，并略作修改。隨機選自12名食品專業(yè)人員對產品進行評定，對褐色酸奶按表2評定標準進行感官評定。感官評定時間為小組成員餐后2～4h，評定不同樣品期間使用無鹽餅干及純凈水來消除樣品影響，以確保感官評價下組成員的感官敏感性。樣品得分按照色澤、口感、氣味、組織狀態(tài)的各自權重給出總體評分（百分制），樣品得分為評價小組成員各自得分中去除一個最高分、去除一個最低分以后的平均得分。

表2 褐色酸奶感官評分標準

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)采集與圖表制作均使用Excel 2003軟件來進行，單因素試驗結果的方差分析采用SPSS19.0軟件來進行，使用單因素模式，顯著性差異P＜0.05。Box-Behnken響應面分析則采用Design Expert8.5軟件來進行。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗設計

3.1.1 蔗糖與葡萄糖比例

褐色酸奶在不同蔗糖與葡萄糖比例下的感官評價得分如圖1所示。

圖1 不同蔗糖與葡萄糖比例下褐色酸奶的感官評分

Buehler等[10]研究指出酸奶發(fā)酵過程中，雖然乳酸菌在利用乳糖發(fā)酵生長過程中具有優(yōu)勢，但是并不表示乳糖是酸奶發(fā)酵的唯一能量來源，葡萄糖是大多數(shù)微生物都能夠利用的糖類。所以當葡萄糖比例較高時，可能會因為少量雜菌生長以及對于乳糖發(fā)酵的干擾，而產生異常的風味物質，所以會令褐色酸奶的感官評分下降。但只要不是葡萄糖水平過高，則不會產生這種情況。

由圖1可知，蔗糖與葡萄糖比例為2:8時褐色酸奶的感官評分顯著低于其他各組（P＜0.05），但當蔗糖比例高于這一水平時，褐色酸奶感官評分之間并沒有顯著差異（P＞0.05），因此蔗糖與葡萄糖比例可以沿用初始設計工藝中的5:5，沿用這一工藝可以在提高現(xiàn)有生產技術的集成程度。

3.1.2 總糖添加量

褐色酸奶在不同總糖添加量下的感官評價得分如圖2所示。

圖2 不同總糖添加量條件下褐色酸奶的感官評分

由圖2可知，隨著總糖含量的提升，褐色酸奶的品質呈現(xiàn)出顯著提高的趨勢（P＜0.05），但當總糖添加量達到8%以后則再無顯著變化（P＞0.05）。這說明糖的增加可以顯著改善褐色酸奶口感，但是當添加量達到8%以后這種改善作用就達到了極限。因此祁牧乳業(yè)褐色酸奶的糖添加量可以固定為8%。

3.1.3 穩(wěn)定劑種類

褐色酸奶在使用不同穩(wěn)定劑時，感官評價得分如圖3所示。

圖3 不同穩(wěn)定劑條件下褐色酸奶的感官評分

由圖3可知，用HBA-2L-5型穩(wěn)定劑制作的褐色酸奶感官評分顯著高于其他2種常用穩(wěn)定劑（P＜0.05），因此祁牧乳業(yè)的褐色酸奶產品可以固定使用HBA-2L-5型穩(wěn)定劑。

3.1.4 褐變溫度

褐色酸奶在不同褐變溫度條件下的感官評價得分如圖4所示。

圖4 不同褐變溫度下褐色酸奶的感官評分

由圖4可知，隨著褐變溫度的提高，褐色酸奶的感官評價也會逐漸提高。93℃和94℃褐變條件下的褐色酸奶感官評分沒有顯著差異（P＞0.05），均超過了72分，但卻顯著高于91℃和92℃褐變條件下褐色酸奶評分（P＜0.05）。當褐變溫度達到95℃時的褐色酸奶評分顯著高于其他各個溫度，分數(shù)超過了77分。雖然理論上講，也許當溫度高于95℃時可以獲得更高評分的褐色酸奶產品，但由于受到現(xiàn)有設備的限制，即使采用高溫蒸汽加熱的方式，95℃基本上也是現(xiàn)有設備的極限參數(shù)了，再要提高溫度就可能超過現(xiàn)有設備對于蒸汽壓力的安全要求，這是在不改變設備的前提下難以做到的，因此祁牧乳業(yè)褐色酸奶的褐變溫度就固定為95℃。

Arena等[3]指出乳制品中的美拉德反應產物是重要的風味物質來源之一，而溫度則是美拉德反應途徑的重要影響因素，部分風味物質只有當溫度超過一定條件時才會產生。所以本文所發(fā)現(xiàn)的試驗現(xiàn)象，很有可能是因為隨著溫度的提升，一些具有獨特香氣的揮發(fā)性成分才會產生，所以溫度越高也就越趨向于產生更高的評分。

3.1.5 褐變時間

褐色酸奶在不同褐變時間下的感官評價得分如圖5所示。

圖5 不同褐變時間下褐色酸奶的感官評分

由圖5可知，隨著褐變時間從120min不斷增加到240min，褐色酸奶的感官評分逐漸升高，然而達到270min時突然下降。為了獲取更加適合的褐變時間，該因素將進入Box-Behnken響應面優(yōu)化設計環(huán)節(jié)。

3.1.6 發(fā)酵溫度

褐色酸奶在不同發(fā)酵溫度下的感官評價得分如圖6所示。

圖6 不同發(fā)酵溫度下褐色酸奶的感官評分

由圖6可知，當發(fā)酵溫度為40℃時，所得褐色酸奶感官評分只有65分左右，而當發(fā)酵溫度提升至42℃時，也就是祁牧乳業(yè)暫定的酸奶發(fā)酵溫度，褐色酸奶評分超過了74分，顯著高于40℃和41℃條件下發(fā)酵的褐色酸奶（P＜0.05）。發(fā)酵溫度為43℃時，褐色酸奶感官評分達到了76.7分。當發(fā)酵溫度超過44℃以后，褐色酸奶評分則顯著下降，與40℃和41℃條件下時差異不顯著（P＞0.05）。該因素可作為Box-Behnken響應面優(yōu)化設計的因素之一。

Zhou 等[11]、He 等[12]以及 Fang 等[13]均研究了花色酸奶的工藝與產品特性，結果發(fā)現(xiàn)當在酸奶中引入其他風味及營養(yǎng)保健成分后，酸奶最適宜的發(fā)酵溫度總會或多或少的發(fā)生變化。42℃與43℃同樣可能是良好發(fā)酵條件，這可能與上述原因有關。

3.1.7 發(fā)酵時間

褐色酸奶在不同發(fā)酵時間下的感官評價得分如圖7所示。

圖7 不同發(fā)酵時間下褐色酸奶的感官評分

由圖7可知，發(fā)酵8h感官評分顯著高于其他各個發(fā)酵時間 （P＜0.05）。該因素可作為 Box-Behnken響應面設計因素之一。相關研究均發(fā)現(xiàn)了與本文研究結果類似的現(xiàn)象，發(fā)酵溫度是控制酸奶及相關花色產品品質的關鍵[16-21]。

3.1.8 冷卻后熟時間

褐色酸奶在不同冷卻時間下的感官評價得分如圖8所示。

圖8 不同冷卻后熟時間下褐色酸奶的感官評分

由圖8可知，未進行冷卻后熟的褐色酸奶得分顯著最低，但冷卻后熟24h就足以獲得良好口感，因此該參數(shù)可固定為24h。

根據(jù)上述分析，5項工藝參數(shù)可以根據(jù)單因素優(yōu)化設計而決定：蔗糖與葡萄糖比例5:5，總糖添加量8%，穩(wěn)定劑為HBA-2L-5型，褐變溫度95℃，冷卻后熟時間為24h，其余3項工藝參數(shù)褐變時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間需要通過Box-Behnken響應面設計確定最佳的工藝參數(shù)組合。

3.2 工藝參數(shù)的Box-Behnken響應面優(yōu)化設計

根據(jù)單因素試驗結果及Box-Behnken中心組合設計原理，以褐變時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）3個因素，以感官評分為響應值進行響應面優(yōu)化試驗，試驗設計方案及數(shù)據(jù)結果見表3。

表3 Box-Behnken響應面優(yōu)化設計方案及數(shù)據(jù)結果

利用Design-Expert軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸方程擬合，其方差分析結果見表4，通過分析，建立以感官評分對褐變時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）的擬合方程如下：

Y=-28154.6+8.7A+1243.3B+116C-0.033AB-0.05AC+1.5BC-0.014A2-14.5B2-10.6C2

通過查詢概率統(tǒng)計表，該模型F=31.88時，P＜0.0001，由表4可知實際模型F=183.43，這說明模型是極顯著的。同樣，通過查表可知，當失擬項F=1.28時，P=0.3946＞0.05，說明模型失擬項不顯著。決定系數(shù)R2=0.9958，校正系數(shù)R2Adj=0.9903，表明感官評分的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，表明該模型能夠很好的對褐色酸奶感官評分值進行分析和預測。

通過方差分析，該模型中的一次項C與二次項A2、B2、C2對感官評分影響極顯著，一次項A與交互項AC、BC對感官評分影響顯著，一次項B與交互項AB對感官評分影響不顯著，表明試驗中褐變時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）都對攪拌型褐色酸奶的感官評分具有較大影響。由3個因素F值大小可以推斷影響攪拌型褐色酸奶的各因素主次順為：C＞A＞B，即發(fā)酵時間＞褐變時間＞發(fā)酵溫度，詳情見表4。

表4 Box-Behnken響應面模型方差分析表

為了考察各個交互項對褐色酸奶感官評分的影響，利用Design-Expert軟件對回歸方程進行運算，作出交互項的三維響應面圖及等高線圖如圖9所示，能比較直觀的解釋各個變量和變量之間的對響應值的影響。通過Design-Expert對建立的回歸方程進行參數(shù)優(yōu)化分析，可得到感官評分最高時最佳生產工藝條件，即褐變時間239.47min、發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時間7.9h，在此條件褐色酸奶的感官評分為82.73。

圖9 交互作用對感官評分的響應面和等高線

利用Design-Expert軟件進行回歸模型預測褐色酸奶的最佳生產工藝方案為即褐變時間239.47min、發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時間7.9h。為了檢驗該回歸模型預測的可靠性，同時考慮到實際生產操作，將最佳生產工藝方案更改為即褐變時間240min、發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時間8h，其他工藝條件為蔗糖與葡萄糖比例5:5，總糖添加量8%，穩(wěn)定劑為HBA-2L-5型，褐變溫度95℃，冷卻后熟時間為24h。在該條件下重復6次試驗，得到產品的平均感官評分為83.1，感官評分的相對誤差為0.44%，與預測值基本一致，說明該模型擬合度較好，能夠較好地預測實際情況。測定其理化指標，酸奶的酸度為72°T，蛋白質含量為 3.8g/100g，脂肪 2.4g/100g，各項指標均符合GB19302-2010要求。

5 結論

通過試驗確定了褐色酸奶的基本生產工藝條件，通過單因素試驗確定了蔗糖與葡萄糖比例5:5，總糖添加量8%，穩(wěn)定劑為HBA-2L-5型，褐變溫度95℃，冷卻后熟時間為24h。再在單因素試驗的基礎上，通過響應面法建立了多元回歸模型，確定了褐色酸奶的其余最佳發(fā)酵工藝條件褐變時間240min、發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時間8h。如此生產的褐色攪拌型酸奶顏色呈現(xiàn)黃褐色，有濃郁的焦糖味。在此條件下的驗證試驗中褐色酸奶的平均感官評分為83.1分與預測值基本一致，最終產品呈黃褐色，焦糖風味與酸奶特有的風味相結合，口感細膩濃稠。