饒軼晟，胡國(guó)濤*，王鳳霞，張 紅，吳雪君，劉黔霞

（1.中低品位磷礦及其共伴生資源高效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550016；2.甕福 （集團(tuán)）有限責(zé)任公司，貴州 貴陽 550000）

碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽、水分六大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為微生物提供了生長(zhǎng)繁殖和代謝的條件，并為合成產(chǎn)物提供相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)［1］。無機(jī)鹽主要可為微生物提供除碳源、氮源以外的各種重要元素，在微生物發(fā)酵的作用是構(gòu)成菌體細(xì)胞成份，作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH、氧化還原電位等，對(duì)發(fā)酵菌體的影響效果雖不及碳源和氮源，但適量的添加可促進(jìn)菌體健康快速的生長(zhǎng)繁殖提高其代謝產(chǎn)物量［2］。磷常以磷酸鹽的形式加入到培養(yǎng)基中，據(jù)市場(chǎng)調(diào)研，在微生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)過程中，考慮到用量大，混合難度等問題，大部分微生物發(fā)酵廠家多使用食品級(jí)磷酸代替磷酸鹽。因此，磷酸對(duì)微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵具有重要作用。

磷酸是一種常見的無機(jī)酸，屬于中強(qiáng)酸，可廣泛應(yīng)用于洗滌、食品、制藥、顏料、電鍍、防銹等行業(yè)。 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［3］（GB2760-2014）中食品工業(yè)用加工助劑使用中明確規(guī)定，磷酸可作為食品工業(yè)用加工助劑（發(fā)酵用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）在發(fā)酵工藝上使用，因此本文特將磷酸作為發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)磷源使用。為探究磷源對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響，本試驗(yàn)選取了釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen）作為培養(yǎng)對(duì)象進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料及試劑

試驗(yàn)菌種：釀酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisi-ae Hansen）。

試劑：食品添加劑磷酸 （85%）、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、瓊脂、硫酸銨、氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、氫氧化鉀等，以上試劑均為分析純。

培養(yǎng)基及試劑：培養(yǎng)基參照 《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程 （第四版）》［4］進(jìn)行配制。YPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基、YPD磷酸鹽培養(yǎng)基 （在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀10 g）、YPD磷酸培養(yǎng)基 （在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸8.46 g，氫氧化鉀4.2 g）。固體培養(yǎng)基配制：按照以上配方，每1000 mL培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂即可。1mg／mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、DNS顯色液參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行配制。

1.2 主要儀器和設(shè)備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋、DHP-9052B型恒溫振蕩培養(yǎng)箱、帶紫外燈超凈工作臺(tái)、DB-XAB型石墨電加熱板、PE Lambda722型紫外可見分光光度計(jì)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母發(fā)酵

采用液體發(fā)酵進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)需要配置基礎(chǔ)YPD、添加磷酸鹽的YPD、添加食品添加劑磷酸的YPD培養(yǎng)基，并在該三種培養(yǎng)基接種同等菌含量的酵母菌，待發(fā)酵72h后判斷三種培養(yǎng)基對(duì)酵母菌發(fā)酵的影響。詳細(xì)試驗(yàn)過程參照文獻(xiàn)［6-7］進(jìn)行。

1.3.2 檢測(cè)方法

1.3.2.1酵母菌發(fā)酵能力檢測(cè)［8］

分別取各液體發(fā)酵培養(yǎng)基250.00 g于500 mL三角錐瓶中，滅菌后接種酵母種子液4%，精確稱量總質(zhì)量后于30℃振蕩培養(yǎng)72 h后稱量發(fā)酵液重量，每組培養(yǎng)基6個(gè)重復(fù)。因每瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)質(zhì)量及接種量相同，因此測(cè)單位時(shí)間內(nèi)發(fā)酵液失重量為二氧化碳的產(chǎn)生量即可反應(yīng)發(fā)酵能力。

1.3.2.2 發(fā)酵液殘?zhí)橇繙y(cè)定［5］

將1.3.2.1培養(yǎng)72 h的發(fā)酵液于5000 r／min離心10 min，取上清進(jìn)行殘?zhí)橇繖z測(cè)。酒精度作為釀酒酵母發(fā)酵能力最重要的指標(biāo)，與酵母糖轉(zhuǎn)化利用率相對(duì)應(yīng)，糖轉(zhuǎn)化利用率高則相應(yīng)酒精度高，反之糖轉(zhuǎn)化利用率低則相應(yīng)酒精度低［9］。

1.3.2.3 產(chǎn)酒精量測(cè)定［10］

取1.3.2.2 已離心的發(fā)酵液，過0.22μm無菌有機(jī)系濾膜。過濾完的液體即為待測(cè)樣品。檢測(cè)參照GB／T13662-2008，黃酒中酒精含量檢測(cè)方法進(jìn)行。

1.3.2.4 總酸、氨基酸態(tài)氮測(cè)定［10］

檢測(cè)參照GB／T13662-2008檢測(cè)方法進(jìn)行。酒中的酸類物質(zhì)作為主要的呈味成分，以總酸含量用來判定酵母產(chǎn)酸能力，具有一定依據(jù)。且酒含有的多種氨基酸，能被酵母進(jìn)一步代謝生成重要風(fēng)味物質(zhì)高級(jí)醇［9］，因此也作為酵母發(fā)酵能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較（LSD）確定組間差異，結(jié)果以 “均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，EXCEL軟件作表。

2 結(jié)果與分析

釀酒酵母發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 釀酒酵母發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，1＃、2＃、3＃培養(yǎng)基中釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳含量分別為9.67、11.12、11.65 g／L，說明培養(yǎng)基中添加適量磷酸及磷酸鹽與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比能夠產(chǎn)生更多的CO2，且磷酸鹽與磷酸的CO2產(chǎn)生量略有差異但不顯著，由此可知在培養(yǎng)基中添加適量的磷酸鹽或磷酸均能夠提高酵母菌的發(fā)酵能力。發(fā)酵液中殘?zhí)橇靠梢苑磻?yīng)酵母對(duì)糖的轉(zhuǎn)化利用能力，試驗(yàn)初始培養(yǎng)基中含糖量相同，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇康?，說明酵母對(duì)糖的轉(zhuǎn)化利用率高，則說明發(fā)酵能力強(qiáng)。1＃、2＃和3＃培養(yǎng)基殘?zhí)橇糠謩e為18.08、10.16、8.627 g／L，說明2＃和3＃培養(yǎng)基中酵母對(duì)糖的轉(zhuǎn)化利用率比1＃高；發(fā)酵液中酒精度 （體積分?jǐn)?shù)）分別為3.75%、4.21%、4.47%，1＃相對(duì)2＃和3＃培養(yǎng)基酒精度較低；而2＃和3＃則沒有顯著性差異；總酸分別為：4.37、5.13、5.15 g／L；氨基酸態(tài)氮分別為0.72、0.83、0.85 g／L，1＃和2＃、3＃培養(yǎng)基之間存在顯著性差異，2＃和3＃培養(yǎng)基之間無顯著性差異。由此可說明培養(yǎng)基中添加磷酸鹽和磷酸均能促進(jìn)酵母菌發(fā)酵，且磷酸鹽與磷酸的效果無顯著性差異。

3 結(jié)語

通過在釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加磷源、以磷酸鹽形式添加磷源、以磷酸形式添加磷源，發(fā)酵72 h后各培養(yǎng)基中二氧化碳產(chǎn)生量、殘?zhí)橇?、產(chǎn)酒精量、發(fā)酵液中總酸和氨基酸態(tài)氮生成量等指標(biāo)的變化來判斷磷源對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知添加磷源，可提高釀酒酵母發(fā)酵能力；而以磷酸鹽形式和以磷酸形式添加磷源，都能夠?yàn)獒劸平湍赴l(fā)酵提供磷源，且促進(jìn)發(fā)酵的效果一致。