常 升 王 銘 奚 志 白宏英 楊霄鵬△

1)鄭州市惠濟(jì)區(qū)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450053 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

老年人易患多種腦血管疾病，隨著中國人口老齡化的增加，發(fā)病率逐漸增加，尤其是腦梗死(CI)，發(fā)病率和病死率高。缺血性腦梗死的發(fā)作主要?dú)w因于一系列血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致腦缺血性壞死或腦組織軟化。一旦發(fā)生缺血性腦梗死，如未及時(shí)有效的治療，會(huì)迅速發(fā)展并造成嚴(yán)重后果[1-2]。CI是神經(jīng)內(nèi)科常見的急危重病癥，是因顱腦局部血循環(huán)障礙引起，通常發(fā)病突然，病情危重，變化快，有著較高病死率和致殘率。腦梗死的病因涉及高血壓、糖尿病、高脂血癥、血管炎、動(dòng)脈粥樣硬化和遺傳因素等。多種因素研究表明[3]，CI的病理生理變化較復(fù)雜，遺傳因素有著重要作用和影響。當(dāng)前，臨床研究的CI有關(guān)候選基因已達(dá)到數(shù)十種。近年來，研究發(fā)現(xiàn)AT1R、MCP-1基因多態(tài)性會(huì)影響到血漿水平[4]，認(rèn)為此種異常表達(dá)和缺血性心腦血管病有著密切關(guān)系。

血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)對(duì)心血管和腎臟系統(tǒng)的病理生理至關(guān)重要[5]。過量會(huì)引起炎癥/氧化反應(yīng)、高血壓、內(nèi)皮功能障礙和血管重塑；各種研究表明，血管緊張素受體1亞型(AT1R)起介導(dǎo)的作用。AT1R基因表達(dá)的增加有助于高血壓和其他相關(guān)心腦血管異常的發(fā)作[6]。趨化因子在選擇性募集單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞以及通過激活G蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)趨化性中起主要作用[7]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1/CCL2)是調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞遷移和浸潤的關(guān)鍵趨化因子之一[8]。MCP-1除了被認(rèn)為是將單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吸引到炎癥位點(diǎn)的有效介體外，還通過血腦屏障介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移，并通過在體內(nèi)形成趨化梯度來調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)[9]。

但關(guān)于兩者和CI預(yù)后的相關(guān)性的研究報(bào)道還不多。本文應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)測(cè)定AT1R及MCP-1基因多態(tài)性，并系統(tǒng)剖析與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1．1一般資料以鄭州市惠濟(jì)區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2018-01—2019-10收治的145例CI患者作為研究對(duì)象，均經(jīng)臨床癥狀、輪腦影像學(xué)等檢查確診，符合CI的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。臨床表現(xiàn)主要是頭痛、失語、偏癱、嘴角歪斜等。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為首發(fā)性缺血性CI，在發(fā)病后6 h內(nèi)送院診治；(2)入院時(shí)GCS評(píng)分>8分，NIHSS評(píng)分<15分；(3)患者及家屬對(duì)研究知情并同意；(4)無用藥禁忌證。排除合并冠心病、肝腎功能不全、惡性腫瘤、凝血機(jī)制障礙、顱腦外傷及不接受隨訪等患者。其中男83例，女62例；年齡52～68(58.6±3.4)歲；發(fā)病到入院5～26(9.2±1.4) h。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且研究流程符合相關(guān)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。

1．2方法

1．2．1 臨床治療：本組患者在確診后均給予專科對(duì)癥治療，包括行顱壓、抗血凝、吸氧、溶栓、改善側(cè)支循環(huán)、營養(yǎng)腦神經(jīng)等；同時(shí)，遵醫(yī)囑給用依達(dá)拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20031342)30 mg+0.9%氯化鈉溶液150 mL，靜注，30 min完成，2次/d，連續(xù)用藥14 d[11-12]。

1．2．2 基因多態(tài)性檢測(cè)：所有患者接受6個(gè)月隨訪，在末次隨訪抽取空腹12 h以上晨起外周肘靜脈血5 mL保存于EDTA抗凝血管待檢，通過低滲法將白細(xì)胞予以分離，再采用氯仿/異戊醇法完成DNA提取，待進(jìn)行基因檢測(cè)。(1)AT1R A1166C，應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)，對(duì)于基因引物設(shè)計(jì)則參照相關(guān)文獻(xiàn)[13]，上游引物：5'-ATAATGTAAGCTCATCCACC-3'，下游引物：5'-GAGATTGCATT TCTGTCAGT-3'，PCR擴(kuò)增反應(yīng)相關(guān)條件：于94 ℃下預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，退火57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，經(jīng)過33個(gè)循環(huán)周期之后于72 ℃下延伸5 min，置于4 ℃恒溫下予以保存。加入5 U內(nèi)切酶DdeI以及酶切緩沖液，置于37 ℃水中浴12 h酶切反應(yīng)，應(yīng)用2.5%瓊脂糖凝膠電泳，予以溴化乙錠染色，再置于紫外燈下進(jìn)行基因型的鑒定：如2個(gè)等位基因上均含內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，且在酶切后產(chǎn)生210 bp、140 bp的片段，則定為CC型；如在酶切之后產(chǎn)生350 bp、210 bp及p140 b的片段，則定義成AC；如不含概酶切位點(diǎn)，僅有350 bp片段，那么定義成AA型。(2)MCP-1 2518基因型。根據(jù)MCP-1 全DNA序列，以及有關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物[13]，上游引物：5'-TCTCTCACGCCAGCACTGACC-3'，下游引物：5'-GAGTGTTCACATAGGCTTCTG-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：于95 ℃預(yù)變性5 min，再轉(zhuǎn)變成95 ℃變性40 s，退火至0 ℃ 30 s，然后72 ℃延伸40 s，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)周期之后，再于72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物置于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增情況，以確定PCR產(chǎn)物是所需目的片段(234 bp)，再對(duì)目的片段實(shí)施限制性酶切：①基本條件：PvuⅡ內(nèi)切酶1 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，去離子水7 μL，緩沖液2 μL，混合均勻后置于37 ℃水中水浴過夜；②基因分型：用2 μL上樣緩沖液溴酚藍(lán)與5 μL酶切產(chǎn)物混合均勻后，應(yīng)用微量吸管把混合液加至凝膠槽孔內(nèi)；③電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察確定基因型，僅顯示234 bp片段為AA型，顯示234 bp、159 bp及75 bp片段為GA型，顯示159 bp、75 bp片段為GG型。

1．3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)在隨訪6個(gè)月后，應(yīng)用mRs量表評(píng)價(jià)患者預(yù)后，0～6分，無癥狀為0分；雖有癥狀，但無顯著殘障；輕度殘障3分；重度殘障4分，嚴(yán)重殘障為5分，6分為死亡。如評(píng)分≤1分為預(yù)后良好，>1分為預(yù)后不良。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將本課題研究資料統(tǒng)一錄入Excel進(jìn)行整理，并應(yīng)用SPSS 12.0 軟件包完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，基因型、等位基因的頻率用%表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1預(yù)后情況本組145例患者出院后均接受6個(gè)月隨訪，無失訪病例，通過mRs評(píng)分，預(yù)后良好90例，占62.07%，預(yù)后不良55例，占37.93%。

2．2預(yù)后良好和預(yù)后不良組AT1R基因多態(tài)性對(duì)比通過對(duì)AT1R A1166C基因檢測(cè)(圖1)，預(yù)后良好組患者AA、AC基因型頻率及C等位基因頻率分別為86.67%、23.33%、5.56%，分別低于預(yù)后不良組的45.45%、54.55%及24.55%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2．3預(yù)后良好和預(yù)后不良組MCP-1基因多態(tài)性對(duì)比通過對(duì)MCP-1 2518G/A基因檢測(cè)(圖2)，預(yù)后良好組的GG基因型頻率為27.78%、G等位基因頻率為43.33%，分別低于預(yù)后不良組的36.36%、54.55%(P<0.05)。見表2。

表1 預(yù)后良好和不良患者的AT1R基因多態(tài)性比較 (%)Table 1 Comparison of AT1R gene polymorphism betweenpatients with good and poor prognosis (%)

表2 預(yù)后良好和不良患者的MCP-1基因多態(tài)性比較 (%)Table 2 Comparison of MCP-1 gene polymorphism betweenpatients with good and poor prognosis (%)

圖1 AT1R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)切酶酶切后瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of AT1R PCR amplified products after endonuclease digestion

圖2 MCP-1 2518G/A的PCR產(chǎn)物酶切電泳圖Figure 2 PCR products of MCP-1 2518G/A digested by endonuclease and then electrophoretic

3 討論

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)在臨床研究中應(yīng)用開來，及遺傳學(xué)技術(shù)、流行病學(xué)試驗(yàn)等研究方法的應(yīng)用，CI遺傳學(xué)的研究不斷深入。當(dāng)前，用于分析人的基因突變和CI發(fā)生及預(yù)后的遺傳流行病學(xué)研究主要是關(guān)聯(lián)分析法，針對(duì)群體病例進(jìn)行對(duì)比研究。人類基因組內(nèi)的遺傳多態(tài)性大多數(shù)表現(xiàn)出重復(fù)序列和普遍性單核苷酸多態(tài)性(SNP)。所謂SNP就是在基因組內(nèi)特定核苷酸所在位置存在的2種不同堿基置換，一般僅為1種二等位基因或二態(tài)遺傳變異，可通過自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)批量化檢測(cè)，與此同時(shí)，因在基因組中SNP的數(shù)量極大，分布密而有著很高的穩(wěn)定性，能夠?yàn)榕R床提供豐富、多樣的基因遺傳變異信息，所以，將其作為新一代的基因遺傳標(biāo)記。伴隨人類基因組計(jì)劃的不斷完善，學(xué)界日益重視基因組SNP，其可充分反應(yīng)出不同群體、個(gè)體間的基因遺傳差異，并基于特定SNP研發(fā)和選用敏感藥物，以實(shí)現(xiàn)高度個(gè)體化的治療和干預(yù)，實(shí)現(xiàn)理想的治療效果和預(yù)后。

AT1R是一種G蛋白偶聯(lián)受體，主要存在于血管平滑肌、心臟等組織內(nèi)，在被血管緊張素II(Ang II)激活之后的效應(yīng)主要在于平衡機(jī)體血壓與水電解質(zhì)，機(jī)體持續(xù)性高血壓狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致心腦血管形態(tài)學(xué)與生理功能發(fā)生改變[14]，如左室重塑、血管形態(tài)改變、內(nèi)皮功能損害等。ATlR基因則位于人3號(hào)染色體長臂21～25區(qū)，A1166C則位于3’未翻譯區(qū)57端，A突變成C會(huì)出現(xiàn)這三種基因型：一是未突變純合子AA型；二是突變雜合子AC型；三是突變純合子CC型。此位點(diǎn)的突變不會(huì)導(dǎo)致其編碼氨基酸序列以及生理功能發(fā)生變化，但是可能會(huì)參與到基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控中，進(jìn)而影響到AT1R對(duì)于Ang Ⅱ親和力改變。研究表明[15]，AT1R基本介導(dǎo)Ang Ⅱ所有臨床效應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致腦動(dòng)脈、微動(dòng)脈收縮效應(yīng)，促進(jìn)兒茶酚胺釋放，引發(fā)血管平滑肌細(xì)胞過度肥厚或增生，減小血管腔/壁比值，影響CI病情的改善。本研究中，對(duì)AT1R多態(tài)性與CI預(yù)后相關(guān)性開展研究，結(jié)果顯示CI預(yù)后良好患者的ATlR AA、AC基因型以及C等位基因的頻率整體高于預(yù)后不良患者(P<0.05)。由此表明，ATlR AA、AC基因型和CI預(yù)后有密切關(guān)系，與相關(guān)課題研究結(jié)論基本一致。

MCP-1會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)游離Ca2+水平增高，表達(dá)粘附分子，釋放溶酶體酶以及超氧陰離子、組織因子以及促炎細(xì)胞因子，致單核/巨噬細(xì)胞激活和聚集，而加重血管腔內(nèi)的脂質(zhì)積累，促使動(dòng)脈血管內(nèi)膜組織細(xì)胞增生，加快動(dòng)脈斑塊生長，引發(fā)CI，不利于病情改善。臨床上對(duì)MCP-1基因進(jìn)行了諸多研究，但對(duì)其2518G/A多態(tài)性和動(dòng)脈粥樣硬化、CI、心梗等缺血性心腦血管病變的預(yù)后間的相關(guān)性機(jī)制尚未完全明確。國外學(xué)者SKALNIAK 等[16]人研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1 2518G/A多態(tài)性血漿脂蛋白a(LP(a))的機(jī)體含量存在相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)[17]，MCP-1 2518GG 基因型人群的LP(a)含量、患心腦血管病變的幾率均顯著高于MCP-1 2518AA基因型人群。高脂蛋白(a)血癥是動(dòng)脈粥樣硬化、CI發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。高脂蛋白(a)血癥和MCP-1 2518 GG基因型可能是通過提高M(jìn)CP-1表達(dá)水平，增加白細(xì)胞聚集，進(jìn)而增加動(dòng)脈粥樣硬化損傷的危險(xiǎn)性[18]。但有學(xué)者認(rèn)為，也可能是通過促進(jìn)脂質(zhì)過氧化來導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化損傷。研究認(rèn)為[15-16]，MCP-1 2518G/A多態(tài)性可能通過影響MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)，來參與調(diào)控病癥發(fā)生發(fā)展中的炎性反應(yīng)，最終對(duì)病癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響。有些刺激因素效用會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生MCP-1的量表現(xiàn)出顯著的個(gè)體性差異，而MCP-1基因-2518G/A多態(tài)性會(huì)對(duì)此轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)域的活性產(chǎn)生影響，并和單核細(xì)胞MCP-1的產(chǎn)量個(gè)體差異表現(xiàn)出一致性。臨床研究發(fā)現(xiàn)MCP-1 2518G/A多態(tài)性和血漿內(nèi)的MCP-1水平表現(xiàn)出一定相關(guān)性，MCP-1 2518位點(diǎn)基因型為含G(GG，GA)者的血漿內(nèi)MCP-1的整體水平要高于AA基因型者[19-20]。本研究顯示預(yù)后良好和預(yù)后不良患者相比，CI患者的MCP-1 2518位點(diǎn)有著較高的G等位基因攜帶頻率(GG，GA)，表明MCP-1 2518G等位基因可能是影響CI轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的重要因素。由此推測(cè)，人體MCP-1基因2518G/A多態(tài)性和CI預(yù)后存在一定關(guān)系。

AT1R位點(diǎn)A1166C及MCP-1基因位點(diǎn)-2518多態(tài)性與CI的預(yù)后可能存在相關(guān)性，這為探索CI的治療和康復(fù)方案、方法的制定提供新的方向和思路。但是因本研究樣本量有限，使得某些基因型頻率整體較少，再加上缺乏區(qū)域性對(duì)比，會(huì)影響到結(jié)論的完整性和可靠性，因而，應(yīng)加大樣本量，選取多區(qū)域病例進(jìn)一步深入研究，以便充實(shí)和完善本課題的結(jié)論。