鐘惠嫻，陳培林，熊風，萬才云，姚志鴻，曾勇，孫青*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳 518045；2. 深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518045)

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)廣泛地應用于男性不育的治療。用于ICSI的精子有手淫射出精子、顯微外科手術(shù)獲得的精子，其中顯微外科手術(shù)精子有經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)(PESA)和睪丸精子抽吸術(shù)(TESA)獲得的精子等。隨著技術(shù)的發(fā)展，不同精子來源以及冷凍對ICSI結(jié)局的影響受到人們的日益關(guān)注[1-4]。囊胚培養(yǎng)技術(shù)是人類輔助生殖技術(shù)中重要的一部分，它通過延長胚胎體外培養(yǎng)時間，能夠有效淘汰部分發(fā)育潛能低下或基因缺陷的胚胎，篩選出發(fā)育潛能更高的胚胎。但是，不同來源冷凍復蘇精子ICSI后對囊胚培養(yǎng)結(jié)局的影響尚不清楚。本研究回顧性分析了2013年7月至2019年1月在本中心使用冷凍復蘇精子行ICSI治療的不孕不育患者的臨床資料，對比分析手淫或手術(shù)(PESA及TESA)獲得精子冷凍復蘇行ICSI治療后胚胎的發(fā)育結(jié)局，包括囊胚形成率、可利用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率，旨在為臨床制定個體化囊胚培養(yǎng)策略提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2013年7月至2019年1月在本中心使用冷凍復蘇精子行ICSI治療的不孕不育患者的臨床資料。納入標準：(1)女方年齡≤40 歲；(2)常規(guī)促排卵方案；(3)行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)>0。排除行PGT-M或PGT-A的周期。

共納入269個治療周期。根據(jù)冷凍復蘇精子來源不同分為手淫組(94個周期)和手術(shù)組(175個周期)，而手術(shù)組根據(jù)手術(shù)位置不同又分為兩個亞組：PESA組(82個周期)和TESA組(93個周期)。

二、方法

1.控制性促排卵及卵母細胞收集：根據(jù)患者的卵巢儲備和反應情況，采取相應的促排卵方案。當有兩個或以上卵泡直徑≥18 mm的優(yōu)勢卵泡時，肌肉注射10 000 U的HCG(珠海麗珠制藥)，注射34～36 h后行陰道B超穿刺負壓抽吸取卵，卵母細胞放入受精培養(yǎng)液(SAGE，美國)中直至授精。

2.精液處理及冷凍復蘇：(1)精液處理：因取精困難、出差等特殊原因?qū)е略谌÷讶諢o法提供精液，或因手術(shù)取精后避免反復手術(shù)帶來創(chuàng)傷的患者，通過提前冷凍精子至取卵日復蘇使用。手淫取精患者，在禁欲2～7 d后，手淫取精后使用Quinn’s 2040和2080(SAGE，美國)進行密度梯度離心法處理精液并冷凍精子；行PESA或TESA取精時，若在顯微鏡20個高倍視野下觀察到活動精子則進行精子冷凍。(2)精子冷凍及復蘇：精子懸液與精子冷凍保護劑(SAGE，美國)按體積1∶1在冷凍管中混勻，室溫靜置10 min，在液氮罐中利用液氮蒸汽熏蒸15 min后投入液氮冷凍保存。取卵日復蘇精子，精子冷凍管在37℃培養(yǎng)箱放置15 min后，將精子冷凍混合液加入到受精培養(yǎng)液中離心，去上清后保留少量液體于離心管中。處理后在顯微鏡下觀察，若有活動精子則行ICSI。

3.配子受精及胚胎移植和冷凍：各周期均采用ICSI授精方式。授精后24 h、48 h、72 h觀察卵裂情況及胚胎發(fā)育情況。授精72 h(Day 3)后對胚胎進行評分評級[5]。優(yōu)質(zhì)胚胎：卵裂球數(shù)目≥7個、碎片≤10%的 Ⅰ級胚胎，以及卵裂球數(shù)目≥7個、碎片>10%且≤20%的Ⅱ級胚胎。根據(jù)患者個體情況及Day 3胚胎的數(shù)量和質(zhì)量，Day 3卵裂胚胎有以下2種處理途徑：(1)在Day 3進行新鮮胚胎移植或胚胎冷凍后剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)；(2)所有胚胎行囊胚培養(yǎng)。

4.囊胚培養(yǎng)：將2～3個胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液滴(SAGE，美國)中培養(yǎng)至Day 5～7，觀察囊胚形成情況。按照Gardner等[6]囊胚分級法對形成的囊胚進行評分，內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞評分均高于C的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚；只要內(nèi)細胞團或滋養(yǎng)層細胞其中之一的評分高于C的囊胚則為可利用囊胚；內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞評分均為C則為非優(yōu)質(zhì)囊胚。

5.觀察指標：MⅡ卵率=MⅡ卵數(shù)/獲卵數(shù)×100%；ICSI受精率=(1PN卵數(shù)+2PN卵數(shù)+多PN卵數(shù)+晚期卵裂數(shù))/注射MⅡ卵數(shù)×100%；卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/受精卵母細胞數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/胚胎培養(yǎng)數(shù)×100%；可利用囊胚率=可利用囊胚數(shù)/囊胚形成數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/囊胚形成數(shù)×100%；繼續(xù)培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)胚胎占比=繼續(xù)培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/胚胎培養(yǎng)數(shù)×100%。以上指標在每個周期均進行計算。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

本研究共納入269個取卵周期，根據(jù)冷凍復蘇精子的來源不同分為手術(shù)組(n=175)和手淫組(n=94)；手術(shù)組由PESA組(n=82)和TESA組(n=93)2個亞組組成。

手淫組與手術(shù)組比較，組間女方年齡、平均獲卵數(shù)、MⅡ卵率、受精率、卵裂率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而兩組間體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、優(yōu)質(zhì)胚胎率及繼續(xù)培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)胚胎率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

TESA組與PESA組比較，女方年齡、BMI指數(shù)、平均獲卵數(shù)、MⅡ卵率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及和繼續(xù)培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)胚胎率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；組間不孕年限、卵裂率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 一般資料比較(-±s)

二、不同來源冷凍復蘇精子的囊胚培養(yǎng)比較

TESA組和PESA組的囊胚培養(yǎng)數(shù)、囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。手淫組的囊胚培養(yǎng)數(shù)顯著低于手術(shù)組(P<0.05)，而兩組間囊胚形成率、可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同來源冷凍復蘇精子的囊胚培養(yǎng)情況比較(-±s)

三、不同來源精子對囊胚培養(yǎng)結(jié)局的影響分析

多重線性回歸分析手淫和手術(shù)冷凍復蘇精子ICSI后對囊胚形成率、可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率的影響。分別以囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率為因變量，不同冷凍復蘇精子來源(手術(shù)vs.手淫)為二分類自變量，同時矯正一元線性回歸分析中P≤0.2的因素(表3)。結(jié)果顯示，手術(shù)組的囊胚形成率顯著低于手淫組(P<0.05)，而可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

表3 影響囊胚培養(yǎng)因素的一元線性回歸分析

表4 多重線性回歸分析不同冷凍復蘇精子ICSI后對囊胚培養(yǎng)結(jié)局的影響

討 論

本研究根據(jù)不同來源冷凍復蘇精子進行分組比較，觀察不同來源精子ICSI后對胚胎囊胚培養(yǎng)結(jié)局的影響。研究結(jié)果顯示，手術(shù)取精中，PESA和TESA冷凍復蘇精子ICSI受精后，胚胎囊胚培養(yǎng)結(jié)局差異無統(tǒng)計學意義。手術(shù)和手淫冷凍復蘇精子ICSI后，多重線性回歸分析結(jié)果顯示，手術(shù)組的囊胚形成率顯著低于手淫組，而兩組間可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率差異無統(tǒng)計學意義。提示手術(shù)來源的精子冷凍復蘇影響ICSI后胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成，但不影響可利用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。

為治療無精子癥患者，臨床上通過顯微外科手術(shù)獲得附睪或睪丸精子，結(jié)合ICSI技術(shù)能夠為無精子癥患者孕育后代帶來可能性。同時使用冷凍技術(shù)進行精子冷凍能夠保存男性生育力，減少了患者因反復手術(shù)帶來的并發(fā)癥。有研究認為，附睪精子的DNA損傷程度顯著高于睪丸精子，所以使用睪丸精子后胚胎的囊胚形成率要顯著高于附睪精子的[7]。另有研究報道睪丸精子染色質(zhì)DNA斷裂水平明顯高于附睪精子，這可能影響胚胎進一步的發(fā)育[8]。目前使用冷凍復蘇附睪或睪丸精子進行ICSI后，更多的是研究胚胎早期卵裂胚情況及妊娠結(jié)局[9-11]，對胚胎行囊胚培養(yǎng)結(jié)局的影響尚未進行研究。本研究結(jié)果顯示，冷凍復蘇的睪丸和附睪精子ICSI后胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示，臨床上凍融睪丸和附睪精子行ICSI治療后，胚胎具有相似的發(fā)育潛能。

精子從體內(nèi)到體外，經(jīng)歷了一系列的成熟過程。不同階段的精子，其成熟度、DNA損傷程度、畸形率、染色體異常比例等存在一些差異[12]，可能影響早期胚胎發(fā)育和胚胎發(fā)育潛能[13-14]。目前，一些研究比較了不同來源新鮮精子ICSI后囊胚培養(yǎng)結(jié)局，但不同來源新鮮精子是否影響ICSI后囊胚形成仍然存在爭議。有研究顯示，新鮮射出精子和附睪精子ICSI后胚胎的囊胚培養(yǎng)結(jié)局無顯著性差異[15]。鄭煒煒等[16]研究指出，新鮮射出精子、睪丸和附睪精子ICSI后組間的囊胚形成率無統(tǒng)計學差異，但睪丸精子與附睪精子的可利用囊胚率顯著高于射出精子。也有學者認為，不同來源的新鮮精子(射出精子、睪丸和附睪精子)對低質(zhì)胚胎的發(fā)育潛能無顯著影響[3]。另外，Balaban等[17]研究顯示，新鮮射出精子的囊胚形成率顯著高于非梗阻性睪丸精子。有研究表明，冷凍復蘇技術(shù)對精子的DNA完整性等有影響[18-19]，雖不影響卵母細胞的受精，但冷凍復蘇后精子DNA損傷顯著提高[20]，當損傷程度較高導致卵母細胞無法修復時，可能引起囊胚形成障礙[14，21-23]。本研究結(jié)果提示，手術(shù)來源的精子冷凍復蘇ICSI后影響胚胎的囊胚形成，但不影響胚胎的可利用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。雖然新鮮睪丸和附睪精子的DNA損傷低于射出精子[24]，但冷凍復蘇對不同來源精子的DNA損傷程度是不清楚的；此外睪丸精子畸形率、染色體異常比例高于射出精子[25]，且手淫組可供選擇的精子較多，挑選到質(zhì)量好的精子的概率更大。這些都可能導致手術(shù)來源精子冷凍復蘇行ICSI的囊胚形成率低于手淫來源精子。

綜上所述，臨床上凍融睪丸和附睪精子行ICSI治療后，胚胎具有相似的發(fā)育潛能。此外，手術(shù)來源的精子冷凍復蘇ICSI后影響胚胎的囊胚形成，但不影響胚胎的可利用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。所以，實驗室可根據(jù)患者的不同情況，選擇不同的冷凍復蘇精子進行ICSI治療，同時可以根據(jù)不同來源冷凍復蘇精子制定不同的選擇性囊胚培養(yǎng)方案。