王莉莉，郝偉明，史雅萍，郅洋，李艷梅，梁云霞，張曉花，宋海霞，姬英英，郭興萍

(山西省生殖科學研究所生殖醫(yī)學中心，太原 030006)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)屬乳多空病毒科，目前已鑒定出多種亞型。臨床上根據(jù)HPV的侵染偏好及致癌性，將其分為高危型、疑似高危型及低危型[1]。其中高危型感染除與生殖道疣、鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)有關，更與女性宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關聯(lián)[1-2]。HPV在女性育齡人群中的攜帶率較高(約為10%)，性傳播及密切生活接觸是其主要的傳播途徑[3]。

近年來國內(nèi)外有文獻報道了HPV感染對育齡人群生育力的影響[4-5]，但對接受輔助生殖技術(ART)治療的不孕不育人群的感染情況及其對妊娠結局影響的報道仍較少，尤其是供精人工授精(artificial insemination by donor，AID)助孕患者。本研究回顧了近5年來在山西省生殖科學研究所生殖醫(yī)學中心接受AID治療的女性患者HPV感染情況，并通過歸納分析探究HPV感染對AID妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2019年6月在本所生殖醫(yī)學中心接受AID治療的824例女性患者的1 834個AID治療周期的病例資料。納入標準：男方因素導致的不育，包括：不可逆的無精子癥(如先天性無睪丸、隱睪、輸精管缺如)、嚴重少弱畸精子癥、不宜生育的嚴重遺傳性疾病等；女方至少一側(cè)輸卵管暢通；無排卵障礙。排除標準：女方高齡(>40歲)；子宮內(nèi)膜炎、治療過程中出現(xiàn)中重度盆腔炎癥等；內(nèi)分泌異常，如基礎性激素水平、甲狀腺功能異常等。根據(jù)女方HPV感染情況，將上述研究對象分為兩組：HPV陽性組共85例(184個周期)與HPV陰性組共739例(1 650個周期)。接受AID治療前，夫婦雙方均知情同意并簽署相關知情同意書。

二、研究方法

1.HPV檢測：進入治療周期前的1個月內(nèi)進行檢測。檢測方法為PCR-反向點雜交法。檢測的HPV型別有：高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59型)、疑似高危型(53、66、68、73、82、83型)和低危型(6、11、42、43、81型)。采用專門的宮頸脫落細胞采集器進行采樣，采樣后對含脫落細胞的宮頸黏液進行處理，提取HPV DNA，經(jīng)PCR擴增、產(chǎn)物雜交、洗膜、顯色等步驟后，通過膜條上各探針區(qū)域的顯色情況判讀受檢者的HPV感染情況。所用檢測試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供，所有操作全部按照試劑盒內(nèi)說明書進行。

2.治療方案：根據(jù)女方排卵情況，選擇自然周期或卵巢微刺激方案。卵巢微刺激方案主要包括氯米芬(CC，高特制藥，塞浦路斯)/人絕經(jīng)期尿促性腺激素(HMG，珠海麗珠制藥)+人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠制藥)或CC+HMG+HCG方案。一般自月經(jīng)第10天左右開始，通過陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，直至優(yōu)勢卵泡破裂。

3.供精精液選擇及處理：所用的供精精液全部來自于山西省人類精子庫。依據(jù)“血型一致(即供精者與男方患者血型一致)”、“1∶5(即每位供精者精液最多只能使5名女性受孕)”、“每周期使用同一供精者精液”的原則，為患者隨機分配精液(1 ml×2支)?；颊咄馐褂煤?，將裝在凍存管中的精液從液氮中取出，置于37℃水浴箱中復蘇10 min。復蘇后通過雙層密度梯度離心法進行處理。處理后精子懸液體積調(diào)至0.5～0.6 ml。

4.人工授精：分為排卵前、后雙次授精和排卵后單次授精。雙次授精：當B超顯示優(yōu)勢卵泡未破但患者尿LH呈陽性，或者人工注射HCG后的當日(一般為HCG后3 h內(nèi))行第1次授精，待B超確認卵泡破裂后行第2次授精；單次授精：B超確認優(yōu)勢卵泡破裂后的24 h內(nèi)，將2支精液同時處理后進行授精。人工授精后均給予黃體支持(地屈孕酮10 mg/次，2次/d，口服2周)。

5.妊娠確認：患者于人工授精術后的第14天來院抽血化驗β-HCG，確定生化妊娠情況；第35天來院行B超檢查，確定臨床妊娠情況，并于孕18周繼續(xù)來院檢查，明確胎兒發(fā)育情況。

6.觀察指標：(1)患者一般情況：女方年齡、HPV感染情況、不孕類型及不孕年限、治療方案、實施周期數(shù)；(2)治療相關參數(shù)：優(yōu)勢卵泡數(shù)、處理前后精子濃度與前向運動精子比例、授精日子宮內(nèi)膜厚度、授精方式；(3)周期妊娠結局：臨床妊娠率、生化妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、HPV感染情況

納入研究的824例女性患者中HPV感染者85例，占10.3%；HPV未感染者739例，占89.7%。其中70例為單一型感染，15例為多型混合感染。單一型感染中高危型(包括疑似高危型)感染60例，占總感染數(shù)的70.6%；低危型感染10例，占總感染數(shù)的11.8%?；旌细腥局校呶Ｐ透腥?1例，占總感染數(shù)的12.9%，其中大部分為2個型別的感染，少數(shù)為3個及3個以上型別的感染，另有4例為低危型與高危型的混合感染，占總感染數(shù)的4.7%。高危型中，感染率最高的為16型(17/85，20.0%)，另一常見高危型18型的感染率較低(3/85，3.5%)，不常見的高危型51型(9/85，10.6%)、52型(12/85，14.1%)、58型(9/85，10.6%)和疑似高危型53型(9/85，10.6%)的感染率較高；低危型中，主要涉及的型別有6型(3/85，3.5%)、42型(5/85，5.9%)和81型(5/85，5.9%)等，其中42和81型檢出率最高，未發(fā)現(xiàn)2種及以上低危型的混合感染。

二、兩組患者一般資料及治療情況比較

除HPV感染情況外，AID患者涉及的其它可能影響妊娠結局的重要因素有：女方年齡、不孕年限、不孕類型、治療方案、實施周期數(shù)、平均優(yōu)勢卵泡數(shù)、授精次數(shù)、精液指標、子宮內(nèi)膜情況等。經(jīng)t檢驗及χ2檢驗，以上各參數(shù)在HPV陰性組及HPV陽性組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料及治療情況比較[(-±s)，%]

三、兩組患者AID妊娠結局比較

納入研究的1 834個AID周期中，HPV陰性組患者實施周期數(shù)為1 650個，HPV陽性組患者實施周期數(shù)為184個，HPV陽性組臨床妊娠率和總流產(chǎn)率略高于HPV陰性組，尚無顯著性差異(P>0.05)；按照流產(chǎn)時間進行細分后，HPV陽性組晚期流產(chǎn)率顯著高于HPV陰性組(P<0.05)，早期流產(chǎn)率及其它妊娠結局指標兩組間比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者妊娠結局比較(%)

討 論

人類ART運用至今，已發(fā)展到胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)乃至卵胞漿置換技術的階段，但人工授精術以其操作簡便、幾乎無創(chuàng)、費用較低等優(yōu)勢，仍然是臨床首選的一線助孕方案[6]。尤其是上世紀80年代末，人類精子庫和AID技術應運而生，解決了不可逆性無精子癥和嚴重染色體異常等問題患者的合法生育需求。目前人工授精的周期臨床妊娠率一般在10%～20%之間，且受諸多因素影響[7-8]。研究已證實其主要影響因素有：女方年齡、不孕年限、治療方案、排卵情況(優(yōu)勢卵泡數(shù))、精子質(zhì)量(活力、濃度)等[7-9]。此外，子宮內(nèi)膜情況、授精時機及次數(shù)、病原體感染情況等作為臨床妊娠率的潛在影響因素也有報道，但結論并不一致[10-12]。

目前納入人工授精術前常規(guī)檢查的病原體檢查項目有解脲支原體、沙眼衣原體、優(yōu)生十項(TORCH)、HBV、HCV、HIV、梅毒、淋球菌等。關于這些病原體對人工授精妊娠結局影響的研究報道較少。與之相比，HPV雖未被列入人工授精術前的必查項目，但其對人工授精、體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠結局都有顯著的不利影響。Depuydt等[13]通過對590名女性的1 529個夫精人工授精(AIH)周期的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，HPV感染者的臨床妊娠率約為未感染者的1/6(1.87% vs.11.36%，P=0.004 1)；2019年，Depuydt等[14]又通過對877個AIH周期和485個AID周期的回顧性分析，再次確認HPV感染可導致人工授精臨床妊娠率顯著下降。Garolla等[15]亦研究發(fā)現(xiàn)HPV感染可明顯降低人工授精與IVF-ET的活產(chǎn)率并增加流產(chǎn)率。一些系統(tǒng)評價與meta分析也得出相似結論[4-5，16]。更有臨床研究顯示，不論接受IVF-ET治療的夫婦任何一方感染HPV，都可帶來至少40%的流產(chǎn)率，而當雙方同時感染HPV時，流產(chǎn)率可達100%[17]。

本研究中，接受AID治療的824名女性中HPV的感染率為10.3%，與其他文獻報道的結論[3]相似。具體分析，呈現(xiàn)出“高危為主、型別多樣”的感染特點。高危型中，感染率最高的為16型，這也是臨床最早發(fā)現(xiàn)、最常見、研究最多的HPV型別[1]。除16型外，另一較常見、報道較多的高危型18型在本研究患者中感染率較低，但是51、52、53、58等型別感染率較高，其原因還有待進一步的流行病學研究。低危型呈現(xiàn)出“感染率低、型別單一”的特點，未發(fā)現(xiàn)2種及以上低危型的混合感染。

從妊娠結局來看，HPV陽性組臨床妊娠率略高于HPV陰性組，活產(chǎn)率及持續(xù)妊娠率略低于HPV陰性組，但均無顯著性差異(P>0.05)。不良妊娠結局中，除異位妊娠率和生化妊娠率外，其余指標HPV陽性組均高于HPV陰性組，其中晚期流產(chǎn)率HPV陽性組顯著高于HPV陰性組(6.9% vs.0.9%，P=0.007)。雖然本研究中兩組研究對象的樣本量相差較大可能會對研究結果產(chǎn)生一定影響，但對HPV感染之外的各項妊娠結局影響因素進行二分類統(tǒng)計檢驗，結果顯示HPV陽性組與HPV陰性組間各項參數(shù)指標均在正常范圍，差異也均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此之前提到的女方年齡、不孕年限、排卵情況等因素均未給HPV陽性組與HPV陰性組妊娠結局帶來明顯影響，對結果的統(tǒng)計分析影響亦較小。提示在忽略樣本量及其它未知影響因素的情況下，女方HPV感染有降低活產(chǎn)率、增加流產(chǎn)率的風險，尤其是晚期流產(chǎn)率，繼而影響AID妊娠結局。2006年Henneberg等[18]通過鼠胚實驗證實，暴露在16及18型HPV DNA下的二細胞胚胎無法繼續(xù)發(fā)育至囊胚，若從四細胞階段開始暴露，雖有一部分胚胎可以繼續(xù)發(fā)育，但大部分胚胎的發(fā)育仍受到阻滯。但本研究中除16、18型外，尚有51、52、58等多個高危型也具有較高的感染率，這些型別是否與AID術后流產(chǎn)存在明確的關聯(lián)性，以及多型混合感染是否會進一步增加流產(chǎn)的風險，目前尚無相關文獻報道，仍需進一步研究。此外，部分動物及人細胞水平的體外研究結果顯示，HPV感染導致流產(chǎn)率增高可能與使用攜帶HPV的精子授精有關[2，4，15]，但由于缺少體內(nèi)研究結果，目前尚無統(tǒng)一結論。另一方面，這些體外的分子或細胞研究也無法闡明母體HPV感染作用于胎兒發(fā)育的具體階段。雖然其具體機制尚待明確，但本研究結果至少提示有HPV感染及既往感染(尤其高危型)的女性在接受助孕治療期間應定期關注HPV感染的進展、復發(fā)情況，通過人工授精獲得臨床妊娠后，應密切關注胎兒的發(fā)育情況。

綜上所述，HPV感染具有“高危為主、型別多樣”的特點，作為一個風險因素，可明顯增加AID術后的晚期流產(chǎn)率。但其影響AID妊娠結局的具體機制仍需進一步深入研究。