張浩 邊詩宇 高飛 王英濱

[摘要] 目的 研究天麻素對AD模型小鼠腦內氧化應激及tau蛋白磷酸化水平的影響。 方法 實驗分為正常對照組、AD模型組（tau 轉基因小鼠）和天麻素治療組，治療組小鼠選取tau轉基因小鼠，隔日給予天麻素[5 mg/（kg·d）]灌胃處理3個月，對照組和模型組小鼠（tau轉基因小鼠）則均給予生理鹽水灌胃處理。通過分子生物學及形態(tài)學相關技術檢測各組小鼠腦內p-tau202磷酸化水平及CHAT的表達;并考察氧化應激相關指標的變化。 結果 Western blot及免疫熒光結果顯示，模型組小鼠腦內p-tau202的表達高于對照組小鼠，而天麻素治療組小鼠腦內p-tau202的表達水平較模型組小鼠降低;氧化應激結果顯示，天麻素干預處理后，小鼠腦內的MDA含量降低，SOD活性明顯升高;Western blot結果顯示，與模型組小鼠相比較，天麻素治療組小鼠腦內CHAT表達水平降低。 結論 天麻素能夠通過減少氧化應激進而降低AD模型小鼠腦內tau蛋白的磷酸化水平，最終起到對神經元的保護作用。

[關鍵詞] 天麻素;阿爾茨海默病;tau蛋白磷酸化;氧化應激;保護作用

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）17-0033-04

The effect of gastrodin on oxidative stress and tau protein phosphorylation in the brain of the mice with Alzheimer's disease

ZHANG Hao1? ?BIAN Shiyu2? ?GAO Fei1? ?WANG Yingbin1

1.Department of Neurosurgery，Division Ⅱ，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang? ?110024，China;2.Biotechnology Major，China Medical University，Shenyang? ?110024，China

[Abstract] Objective To mainly study the effect of gastrodin on oxidative stress（OS） and tau protein phosphorylation in the brain of the AD model mice. Methods In the experiment，the subjects were divided into the normal control group，the AD model group（tau transgenic mice）and the gastrodin intervention group. Tau transgenic mice were selected into the intervention group， which received gastrodin[5 mg/（kg·d）] in the form of intragastric administration every other day for 3 m， while normal saline was administrated in intragastric form to the mice in the control group and the AD model group（tau transgenic mice）. The p-tau202 phosphorylation level and the expression of CHAT in the brain of each group of mice were detected by the relevant techniques of molecular biology and morphology， and the changes of OS related indexes were also investigated. Results Western blot and immunofluorescence results showed that the p-tau202 expression in the brain of tau transgenic mice was higher than that in the brain of the mice in the control group， while the p-tau202 expression level in the brain of the mice in the gastrodin intervention group was lower than that of tau transgenic mice. OS results showed that after gastrodin intervention， MDA content in the brain of the mice decreased and SOD activity significantly increased. Western blot results showed that compared with that of the mice in the AD model group，the CHAT expression level in the brain of the mice in the gastrodin intervention group decreased. Conclusion Gastrodin can reduce the phosphorylation level of tau protein in the brain of AD model mice by reducing OS，and ultimately play a protective role on neurons.

[Key words] Gastrodin; Alzheimer's disease（AD）; Tau protein phosphorylation; Oxidative stress（OS）; Protective role

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是由德國學者Alois Alzheimer發(fā)現的一種中樞神經系統(tǒng)變性病，迄今為止已有100多年的研究歷史[1-2]。如今，AD發(fā)病率逐年上升，并已成為世界上最常見的癡呆類型[3-4]。AD的主要病理特征主要體現在兩方面：①大腦皮質、海馬、杏仁核和丘腦中出現大量β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β，Aβ）沉積形成的老年斑（Senile plaque，SP）;②大腦皮質和海馬存在大量由tau蛋白過度磷酸化進而形成的神經纖維纏結（Neurofibrillary tangles，NFTs）[5-7]。AD發(fā)病的確切原因尚不清楚，發(fā)病機制復雜，其病因與多種因素有關。研究表明，氧化應激損傷參與AD的發(fā)病過程，并在AD發(fā)病機制的眾多學說中，氧化應激學說與其他諸多假說之間存在間接或直接的聯系。

天麻素（Gastrodin/gastrodine，GAS）是中藥天麻塊莖的主要成分之一。研究表明，GAS在鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化自由基等多方面功效明顯，令人感興趣的是，在體內實驗中發(fā)現，GAS不僅能夠保護神經元，而且還可以抑制神經膠質細胞的活化，減少 Aβ老年斑沉積，有效改善學習記憶功能障礙[8-9]。上述結果證實GAS在AD防治方面具有重要的理論意義，但GAS對 AD小鼠腦內tau蛋白磷酸化的影響及其作用途徑和機制目前尚未清楚。

為此，本實驗應用3月齡tau 轉基因小鼠，采用相關實驗技術，檢測天麻素對tau轉基因小鼠腦內tau蛋白磷酸化水平的影響，并考察各組小鼠氧化應激相關指標的變化，最后通過Western blot方法檢測小鼠腦內CHAT的表達，有望將天麻素作為防治AD的新靶點，為延緩AD發(fā)病進程奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗藥品? 天麻素（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-18030827），CHAT（abcam，貨號：ab181023），β-actin（Cell Signaling Technology，貨號：4970s），鼠抗tau（Cell Signaling Technology，貨號：4019s）、兔抗p-tau Ser 202（Cell Signaling Technology，貨號：39357s），ECL試劑盒（Pierce，CA貨號：BTB320098），熒光二抗（ThermoFisher，貨號：A-11037），蛋白marker（ThermoFisher，貨號：26616），丙二醛（MDA）試劑盒（齊一生物科技有限公司，貨號：QYS-23035），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（齊一生物科技有限公司，貨號：JK5301）。

1.1.2 主要儀器? 離心機（美國Beckman Allegra X-30R），水平搖床（捷星實驗儀器），Bio-RAD酶標儀（美國Bio-Rad iMark），BIO-RAD凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad ChemiDoc XRS+），臺式高速離心機（Genespeed），激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司TCS SP8）。

1.1.3 實驗動物? 3月齡tau轉基因小鼠（Stock Number 008169）和C57BL/6由中國醫(yī)科大學病理生理實驗室提供。體重為15～22 g，實驗所用小鼠均按照組別分籠飼養(yǎng)，每籠3只，自由飲食水，動物房的室內溫度保持在20°C～25°C。

1.1.4 動物分組及給藥處理? ?稱取 200 mg天麻素于高壓過的 EP 管中，向其中加入1 mL的生理鹽水溶解，使其終濃度為 200 mg/mL備用。

小鼠出生后1個月，提取鼠尾DNA，PCR鑒定出tau轉基因小鼠，同時，通過剪指甲的方式將小鼠標記序號。實驗開始前，根據SPSS統(tǒng)計學軟件產生的隨機數字分為AD模型組（tau轉基因小鼠）和天麻素治療組（tau轉基因小鼠+天麻素干預），每組小鼠隨機選取15只，同背景同月齡C57BL/6小鼠15只，設為正常對照組。具體給藥方式如下所示：對照組和tau轉基因組小鼠，隔日給予生理鹽水灌胃處理;天麻素治療組小鼠，將tau轉基因小鼠按隔日給予5 mg/（kg·d）天麻素灌胃，時間均為3個月。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腦組織取材? 每組小鼠CO2吸入麻醉，仰放在灌流操作臺上，剪去胸腹部的皮毛，采用生理鹽水心臟灌流，灌流完成后，迅速斷頭并用手術鑷子剝離小鼠頭骨，剝離出小鼠大腦，將完整的小鼠大腦分成左右兩部分，其中一半大腦常規(guī)制備冰凍切片，用于形態(tài)學實驗;另一半大腦用于分子生物學實驗檢測。

1.2.2 Western blot? 取各組小鼠大腦海馬組織，加入組織重量10倍的蛋白裂解液，超聲裂解，之后放于冰上繼續(xù)裂解1.5 h，低溫下15 000 g離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白分裝后置于-80℃保存。電泳過程：濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%，蛋白樣品加樣后，進行凝膠電泳，電泳條件為90 V，約15 min，之后調至120 V，直至溴酚藍指示劑到凝膠底部。轉膜過程：轉印液為1×Transfer buffer，按順序放入轉印板陽極-海綿-濾紙兩張-PVDF膜-分離膠-濾紙兩張-海綿-轉印板陰極，轉印板置于電泳槽中，加入冰盒，120 V，轉膜2 h。p-tau 202或CHAT抗體（1：3300）4°C孵育過夜，1×TBST沖洗5 min×3次，二抗室溫下孵育1 h，1×TBST沖洗5 min×4次，ECL發(fā)光，Kodak-XAR 膠片曝光，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。

1.2.3免疫熒光染色和共聚焦激光掃描顯微術? 組織通過4%多聚甲醛固定，30%蔗糖沉糖，于冰凍切片機切片。制備出的冰凍切片于室溫下自然晾干，在腦組織周圍用組化筆畫圈，dd H2O水化5 min，0.01 M PBS沖洗5 min×3次，血清封閉1 h，之后0.01 M PBS沖洗5 min×3次，一抗（1：100）4℃孵育過夜，熒光二抗分別孵育1 h，注意實驗過程要避光，0.01 M PBS沖洗10 min×4次，滴加防熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察染色效果，并于40×鏡下拍照（標尺長度50 μm）。

1.2.4 氧化應激指標檢測? 小鼠腦組織SOD活性及MDA含量測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，每組實驗平行重復3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 天麻素對tau轉基因小鼠腦內tau蛋白磷酸化水平的影響

Tau蛋白異常磷酸化是AD主要的病理學改變之一。實驗中，給予tau轉基因小鼠天麻素治療后，應用免疫熒光觀察小鼠海馬CA3區(qū)p-tau 202磷酸化水平。實驗結果提示，與對照組小鼠比較，模型組小鼠（tau轉基因小鼠）大腦海馬CA3區(qū)p-tau 202的表達明顯增加，整合光密度分析顯示，其值分別為（0.053±0.010）和（0.116±0.009）;與模型組小鼠比較，天麻素治療組小鼠（tau轉基因小鼠+天麻素）腦內p-tau 202磷酸化水平減少，整合光密度值為（0.052±0.011）（P<0.05），見封三圖7A。應用Western blot分別對三組小鼠大腦海馬p-tau 202 表達水平進行分析。結果顯示，模型組小鼠（tau轉基因小鼠）腦內p-tau 202的表達水平顯著高于對照組小鼠，而天麻素治療組小鼠（tau轉基因小鼠+天麻素）腦內tau蛋白在202位點的磷酸化水平較模型組小鼠有所降低，三組小鼠WB灰度值分析的數值分別為（100±0）、（406.0±15.1）和（174.0±18.0）（P<0.05），見封三圖7B。

2.2天麻素對tau轉基因小鼠腦內氧化應激相關指標的影響

通過對三組小鼠腦內MDA含量和SOD活性的檢測考察天麻素對tau轉基因小鼠腦內氧化應激的影響。同對照組小鼠相比較，模型組小鼠（tau轉基因小鼠）腦內SOD活性下降，MDA含量明顯升高;天麻素治療后，治療組小鼠（tau轉基因小鼠+天麻素）腦內SOD活性升高，MDA含量有所降低，見表1。

2.3 天麻素對tau轉基因小鼠腦內膽堿能神經元的保護作用

為了探討天麻素是否能夠對tau轉基因小鼠腦內的膽堿能神經元起到保護作用，本研究采用分子生物學的實驗方法考察了各組小鼠腦內CHAT的表達水平。Western blot結果顯示，與模型組小鼠（tau轉基因小鼠）相比，天麻素治療組小鼠（tau轉基因小鼠+天麻素）腦內CHAT的表達顯著降低，WB灰度值分析顯示，三組小鼠的數值分別為（100±0）、（344.0±15.9）和（167.0±33.5）（P<0.05），見圖1。上述結果說明天麻素可以保護tau轉基因小鼠腦內的膽堿能神經元。

注：Western blot方法考察各組小鼠腦內CHAT的表達變化。與野生對照組小鼠相比，*P<0.05;與模型組小鼠相比，#P<0.05

3 討論

AD的神經病理學改變之一是神經細胞內出現tau蛋白異常磷酸化而引起的NFTs[6]。健康人的腦內，tau蛋白的主要作用是與神經元微管結合并可以調節(jié)微管的結構和功能，同時，通過與多種蛋白間相互作用行使如維持突觸可塑性及軸漿運輸等重要的生理作用[10-11]。然而，在AD患者腦內，tau蛋白發(fā)生異常磷酸化，這種過度的磷酸化可導致tau蛋白喪失上述生理功能，引發(fā)神經元軸突退化，最后聚集形成成對的螺旋絲，即所謂的神經元纖維纏結[12]。研究顯示，在AD發(fā)病早期，患者腦內的tau蛋白磷酸化水平明顯高于正常人水平[13]。上述的神經元病理改變會影響其突觸發(fā)揮正常的生理功能，并最終導致學習及記憶功能的喪失[14-15]，因此，tau蛋白異常磷酸化在AD病變的過程中起著關鍵作用。

AD的發(fā)病機制尚不十分明確，目前認為，氧化應激是導致阿爾茨海默病等神經退行性疾病發(fā)生的重要原因之一，而且，在神經元損傷之前氧化應激就已經發(fā)生。其作用機制主要體現在氧自由基的產生增多和氧自由基清除障礙等兩方面，在上述機制的作用下，腦組織極易受到氧自由基的攻擊，進而誘發(fā)或加重疾病。文獻顯示，氧化應激產生的大量氧化自由基參與老年斑的產生及神經元纖維纏結的過程，這些自由基能夠使一些生物大分子發(fā)生過氧化，引起神經元凋亡，最終引發(fā)學習記憶功能的喪失[16]。也有文獻證實，Aβ老年斑介導自由基的攻擊過程，同時氧化應激也能夠促進老年斑的形成[17];此外，神經元纖維纏結中存在有大量的過氧化產物，tau蛋白被這種過氧化產物修飾后更易磷酸化，進而加重AD的發(fā)病。同時，作為氧化應激的標志性產物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）也發(fā)生明顯的變化。由此可見，氧化應激與AD的發(fā)病過程密切相關。

天麻素是中藥天麻塊莖的主要成分之一，藥理學研究提示，天麻素具有重要的抗氧化應激、抗炎和抗凋亡作用，還能夠改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力。文獻報道，天麻素可通過調控Nrf2/HO-1信號通路，下調炎癥蛋白iNOS表達，進而減輕炎癥反應，起到保護神經元的作用;此外，天麻素還可以通過激活p38 MAPK/Nrf2信號通路，誘導HO-1表達，減少氧化應激引起的SH-SYSY細胞死亡[18]?？梢?，天麻素通過其抗炎及抗氧化的作用，對中樞神經系統(tǒng)發(fā)揮保護作用。但是天麻素是否能夠降低氧化應激反應以及是否能夠降低tau蛋白磷酸化呢？為了探討這一問題，本研究選用AD經典模型tau轉基因小鼠，通過分子生物學和形態(tài)學的實驗技術考察天麻素對tau蛋白磷酸化的影響;并對氧化應激相關指標進行檢測。實驗結果表明，天麻素能夠降低AD模型小鼠腦內p-tau202的表達;此外，天麻素治療組小鼠腦內MDA含量明顯降低，SOD活性有所升高;治療后的小鼠腦內CHAT的表達較AD模型小鼠降低。上述實驗表明，天麻素可以通過減少氧化應激降低AD模型小鼠腦內tau蛋白的磷酸化水平，從而對神經元起到保護作用。但是，天麻素是通過哪一信號通路發(fā)揮作用的是我們需要繼續(xù)研究的問題。

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（收稿日期：2019-12-03）