張民達(dá)，劉夢(mèng)婷，李小瑩，劉秀斌，曾建國(guó)

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸藥湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128

甜葉菊Steviarebaudiana又名甜草、甜菊、甜茶，是一種菊科多年生草本植物。甜葉菊含有多種功能性成分，包括糖苷類、黃酮類、綠原酸類等。甜葉菊糖苷類化合物種類最多、含量最大，具有極高的甜度，其中甜菊苷甜度為蔗糖的300倍[1]，作為甜味劑在食品、藥品、化工、釀酒等行業(yè)中廣泛使用。目前甜葉菊主要作為生產(chǎn)的甜菊糖苷的原料，而針對(duì)綠原酸等活性成分開(kāi)發(fā)利用的研究較少。

綠原酸類多酚成分是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，為金銀花和山銀花中抗菌、抗病毒的主要有效成分。隨著對(duì)綠原酸研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降糖等多種活性作用[2]。目前，已在甜葉菊中發(fā)現(xiàn)包含咖啡?？鼘幩?、二咖啡酰奎寧酸和三咖啡?？鼘幩嵩趦?nèi)的24種綠原酸類化合物[3]；另外，甜葉菊中還含有具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖等生物活性的槲皮苷等黃酮類成分[4]。綠原酸已經(jīng)作為一種飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)中[5]，而異綠原酸作為飼料添加劑在代替抗生素使用、提高飼料利用率及加強(qiáng)生產(chǎn)性能等方面具有良好前景[6]。從甜葉菊中生產(chǎn)甜菊糖苷的同時(shí)，開(kāi)發(fā)利用綠原酸和槲皮苷等活性成分，這為實(shí)現(xiàn)甜葉菊資源的綜合利用和低成本獲得綠原酸和槲皮苷的原料來(lái)源提供了新的思路。由于多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式需要對(duì)照品的種類和數(shù)量均比較大，且部分對(duì)照品價(jià)格比較昂貴且難以獲得，王智民等[7]提出了一測(cè)多評(píng)的多指標(biāo)質(zhì)控模式，即在多指標(biāo)質(zhì)量控制時(shí)，以樣品中對(duì)照品廉價(jià)易得的常見(jiàn)成分為內(nèi)標(biāo)，建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子(Relative Correction Factor，RCF)，再通過(guò)校正因子計(jì)算出其他成分的含量。在方法實(shí)施時(shí)，可在只有1個(gè)對(duì)照品而其余對(duì)照品不足的情況下，實(shí)現(xiàn)這些成分的同步含量測(cè)定，并已成功應(yīng)用于苦參、丹參注射液、黃柏、附子、雙黃連口服液等中藥的質(zhì)量控制[8]。其中黃連藥材的一測(cè)多評(píng)法(QAMS)被收錄于2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》[9]。付曉等[10]采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定甜葉菊中3種綠原酸類化合物，為了更加全面地評(píng)價(jià)甜葉菊原料及提取物中綠原酸和槲皮苷等有效成分的含量，本實(shí)驗(yàn)利用HPLC以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，采用斜率校正法建立其與甜葉菊中其他5種綠原酸類成分新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的相對(duì)校正因子，同時(shí)建立綠原酸與槲皮苷在相同條件下的相對(duì)校正因子。并計(jì)算各成分含量，同時(shí)采用外標(biāo)法同步測(cè)定，驗(yàn)證QAMS得到結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)、Agilent ChemStation工作站、Waters E2695、Waters ACQUITY Arc 高效液相色譜系統(tǒng)(USA，Waters)，Empower工作站；色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱、華譜新創(chuàng)Unitary C18柱和Diamoncil C18柱(色譜柱規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm)；十萬(wàn)分之一電子天平(USA，METTLER TOLEDO)。

綠原酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201415，純度：96.20%)；新綠原酸(德思特生物，批號(hào)：DST180130-015，純度：99%)；隱綠原酸(德思特生物，批號(hào)：DST180210-035，純度：99%)；異綠原酸B(德思特生物，批號(hào)：DST180130-037，純度：99%)；異綠原酸A(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111782-201706，純度：97.3%)；異綠原酸C(德思特生物，批號(hào)：DST180210-038，純度：99%)；槲皮苷(一飛生物，批號(hào)：F316202，純度：98%)；甲醇(色譜純，德國(guó) Merck公司)；磷酸(色譜純，美國(guó) Tedia公司)。

甜葉菊樣品由山東省諸城市浩天藥業(yè)有限公司提供，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾建國(guó)教授鑒定為甜葉菊正品，粉碎，過(guò)40目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 QAMS的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1% 磷酸水(B)，梯度洗脫(0～1 min，10%～25%A；1～5 min，25%～25%A；5～12 min，25%～35%A；12～13 min，35%～45%A；13～30 min，45%～45%A)；體積流量1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：0～23 min，330 nm，23～30 min，350 nm，柱溫25 ℃。樣品圖譜和混合對(duì)照品圖譜見(jiàn)圖1。

注：A.甜葉菊樣品；B.對(duì)照品；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.異綠原酸B；5.異綠原酸A；6.異綠原酸C；7.槲皮苷。圖1 甜葉菊樣品及對(duì)照品的HPLC圖

2.1.2供試品溶液的制備 取甜葉菊樣品，精確稱取0.5 g于50 mL容量瓶中，70%甲醇溶解，搖勻并定容，超聲2 h后用70%甲醇溶液補(bǔ)齊液面至刻度線，過(guò)0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.1.3對(duì)照品混合對(duì)照品溶液的制備 精確稱取綠原酸0.009 66 g、新綠原酸0.001 76 g、隱綠原酸0.001 60 g、異綠原酸B 0.002 11 g、異綠原酸A 0.008 13 g、異綠原酸C 0.005 36 g、槲皮苷0.002 96 g于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，搖勻并定容，過(guò)0.45 μm濾膜，即得對(duì)照品混合對(duì)照品溶液。

2.1.4線性系列溶液的制備 取混合對(duì)照品溶液，采用逐級(jí)稀釋法分別稀釋2、5、10、20、40、60、100倍，共獲得7個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.1.5線性及檢測(cè)限與定量限 分別精密吸取線性系列溶液上機(jī)檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取線性系列溶液濃度最低者，不斷稀釋，取1 mL置于液相小瓶中，按2.1.1方法上機(jī)檢測(cè)，分別取S/N為10、3作為各個(gè)物質(zhì)的定量限及檢測(cè)限。見(jiàn)表1。

2.1.6相對(duì)校正因子 各個(gè)物質(zhì)相對(duì)校正因子為其標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與內(nèi)標(biāo)綠原酸的斜率之比，計(jì)算得到新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，槲皮苷的相對(duì)校正因子分別為1.08、1.12、1.17、1.33、1.27、0.63。

2.1.7準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取0.25 g樣品9份于50 mL容量瓶中，按高(150%)、中(100%)、低(50%) 3個(gè)濃度各3份加入7個(gè)對(duì)照品適量，70%甲醇溶解并定容，按照2.1.2項(xiàng)方法提取。按2.1.1項(xiàng)方法進(jìn)樣，計(jì)算平均加樣回收率。得到綠原酸，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷的不同添加水平的平均回收率分別為102.74%、102.51%、103.23%、101.68%、98.11%、96.61%、99.87%。RSD分別為：6.98%、6.95%、2.93%、5.20%、6.18%、5.76%、5.09%。

2.1.8重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品6份，照2.1.2項(xiàng)下方法平行制備，進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算7個(gè)化合物的含量，其RSD分別為1.05%、0.98%、1.23%、1.00%、0.99%、1.00%、1.11%。表明重復(fù)性良好。

2.1.9日內(nèi)日間精密度 精密移取高、中、低3個(gè)濃度混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各成分的峰面積。計(jì)算得到綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷低濃度的RSD分別為0.1%、0.1%、0.2%、0.2%、0.0%、0.1%、1.1%；中濃度的RSD分別為0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.0%、1.1%、1.1%；高濃度的RSD分別為1.3%、1.3%、1.3%、1.2%、1.3%、1.2%、1.5%；精密吸收中濃度混合對(duì)照品溶液，每天進(jìn)樣3次，連續(xù)3 d，記錄峰面積。計(jì)算得到綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷的RSD分別為2.0%、2.0%、2.3%、1.9%、2.1%、2.0%、2.1%。表明日內(nèi)日間精密度良好。

2.2 耐用性

2.2.1柱溫和流速耐用性 在相同條件下，分別考察不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)和不同柱溫(20、25、30 ℃)對(duì)7個(gè)物質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果顯示不同流速和柱溫對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響較大(RSD>5.0%)，檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)對(duì)柱溫和流速嚴(yán)格控制以確保結(jié)果的準(zhǔn)確。

2.2.2相對(duì)校正因子的耐用性 本實(shí)驗(yàn)分別選用Agilent 1260、Waters E2695和Waters ACQUITY Arc 3套高效液相色譜系統(tǒng)與3種不同色譜柱考察色譜系統(tǒng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果顯示不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對(duì)RCF的影響較小(RSD<4.0%，重復(fù)性良好，見(jiàn)表2)。

表1 6種綠原酸類成分及槲皮苷的線性及檢測(cè)限與定量限

表2 一測(cè)多評(píng)法不同色譜系統(tǒng)與色譜柱條件下6種綠原酸成分相對(duì)校正因子的耐用性

2.3 與外標(biāo)法的比較

分別采用QAMS與外標(biāo)法對(duì)15批甜葉菊樣品進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示：1)外標(biāo)法與QAMS結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2)不同批次樣品中7個(gè)物質(zhì)的總量差異較大，各成分比例也存在較大差別。

3 討論

3.1 建立對(duì)槲皮苷的含量測(cè)定方法

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，甜葉菊中含有大量黃酮類活性成分槲皮苷。在利用綠原酸建立新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的相對(duì)校正因子的同時(shí)，也對(duì)槲皮苷的相對(duì)校正因子進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果顯示此方法可以用來(lái)測(cè)定甜葉菊中槲皮苷的含量。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)：綠原酸，新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C具有相近的最大吸收波長(zhǎng)，均在330 nm附近，故選擇330 nm作為綠原酸類多酚的檢測(cè)波長(zhǎng)。而槲皮苷的最大吸收波長(zhǎng)在350 nm處。選擇350 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表3 15批甜葉菊樣品QAMS與外標(biāo)法的比較結(jié)果 %

3.3 色譜峰的定位

色譜峰的定位是通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)的。本研究考察發(fā)現(xiàn)柱溫和流速改變對(duì)各成分相對(duì)保留時(shí)間的影響較大，不利于色譜峰的定位。但各成分的出峰順序不受影響。在QAMS中，可以通過(guò)各成分的出峰順序，計(jì)算待測(cè)組分與內(nèi)參的保留時(shí)間差值。同時(shí)參考各成分的紫外吸收特征，基本可以確定各目標(biāo)峰的位置。

3.4 質(zhì)量評(píng)價(jià)

目前對(duì)甜葉菊原料的利用主要集中在甜菊糖苷的開(kāi)發(fā)利用上，針對(duì)綠原酸等活性成分開(kāi)發(fā)利用的研究較少。可以從甜葉菊中開(kāi)發(fā)利用綠原酸和槲皮苷等活性成分，從而實(shí)現(xiàn)甜葉菊資源的綜合利用。由于不同甜葉菊中各成分比例具有較大差異，其中任意一種成分的含量都不能正確反映甜葉菊的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，采用QAMS對(duì)甜葉菊葉片原料中6種成分進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果證明此方法在準(zhǔn)確度、線性范圍、重復(fù)性、日內(nèi)日間精密度等都符合要求?？疾炝瞬煌V儀、不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果表明相對(duì)校正因子不受上述色譜條件的影響；同時(shí)也在此條件下對(duì)槲皮苷的含量進(jìn)行了控制。采用外標(biāo)法和QAMS對(duì)15批甜葉菊葉片原料進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果無(wú)顯著性差異，證明所建立的相對(duì)校正因子定量分析方法可行，故可采用以綠原酸對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)的QAMS測(cè)定甜葉菊葉片原料中綠原酸類6種活性成分的含量以評(píng)價(jià)甜葉菊原料的質(zhì)量。