王士杰,李晨光,何 穎,馮淑月

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院·吉林吉林·132109)

桔梗是常用的大宗中藥材,主產(chǎn)于我國(guó)東北、華北、華東、華中等地區(qū)，在國(guó)內(nèi)各個(gè)地區(qū)也均有不同面積種植[1,2]。其根入藥,為藥食兩用品種，具有很好功效營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及觀賞性的。桔梗的藥用價(jià)值比較高，桔梗飲片可用于咳嗽痰多，胸悶不暢。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不斷完善,受到植物培育研究的廣泛關(guān)注,并得到迅速發(fā)。無(wú)土栽培技術(shù)研究在我國(guó)起步還比較晚,香石竹(Dianthus caryophyllus)、唐菖蒲 (Gladiolus gandavensis)、菊花等花卉無(wú)土栽培試驗(yàn)的成功為我國(guó)無(wú)土栽培打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)[3]。以桔梗種子做為試驗(yàn)材料，一定條件下催芽，再以白花桔梗和紫花桔梗幼芽為材料，建立了愈傷培養(yǎng)、誘導(dǎo)生芽生根等一整套完整的抗性培養(yǎng)植株再生模型，培養(yǎng)具有抗鹽性基因的桔梗苗木。該研究為豐富桔梗品種和快速培育桔梗提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白花桔梗和紫花桔梗種子實(shí)驗(yàn)材料在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院左家校區(qū)桔梗種植基地采集。

1.2 試驗(yàn)儀器

752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海奧普勒儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FB（蘇州凈化有限公司）等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基制備

MS、N6培養(yǎng)基配制。

2.2 幼芽的培育

選擇色澤飽滿的白花桔梗種子和紫花桔梗種子，放在溫水中浸泡過(guò)夜后撈出，放在燒杯中，燒杯中放上濕的棉花為種子提供水分，將燒杯放在（25±1）℃的恒溫箱中，每天用恒溫水沖洗數(shù)次通風(fēng)，進(jìn)行催芽處理，半個(gè)月左右，等到種子長(zhǎng)出5cm左右幼嫩的芽進(jìn)行備用。

2.3 幼芽的接種

將白花，紫花桔梗幼嫩的芽切塊（約2～5cm），用自來(lái)水反復(fù)清洗備好的幼芽20min，用洗衣粉水消毒15min，經(jīng)消毒的幼芽，放在超凈工作臺(tái)中，吸干表面水分用濾紙，將白花、紫花桔梗幼芽材料分別接中于不同的培養(yǎng)基中，不同的培養(yǎng)基中接6瓶，每瓶5株，在溫度 （25±1）℃的溫度下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2500～3000lx,光照時(shí)間長(zhǎng)為12h的條件下培養(yǎng)15天左右，對(duì)其發(fā)芽數(shù)進(jìn)行記錄，以下步驟組培條件同此條件一致。

2.4 誘導(dǎo)愈傷

以接種處理中最佳的培養(yǎng)條件為基本培養(yǎng)基，在不同濃度IBA和NAA的條件下，分別對(duì)白花桔梗和紫花桔梗進(jìn)行誘導(dǎo)，得出適于愈傷組織分化明顯的實(shí)驗(yàn)組。得出誘導(dǎo)效果好的一組處理。待生長(zhǎng)穩(wěn)定后接種到含有不同鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行抗鹽篩選。

2.5 生根培養(yǎng)

以誘導(dǎo)培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)條件為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)30天左右記錄生根情況，對(duì)白花桔梗和紫花桔梗培養(yǎng)基中的生根數(shù)、生長(zhǎng)勢(shì)等進(jìn)行測(cè)量。

2.6 移栽培養(yǎng)

觀察白花桔梗和紫花桔梗組培苗生根情況對(duì)其組培苗進(jìn)行篩選，通過(guò)觀察白花、紫花桔梗苗的生長(zhǎng)勢(shì)、葉片顏色、苗的長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行篩選，篩選出各項(xiàng)物理指標(biāo)較高的白花桔梗和紫花桔梗苗木。把白花桔梗和紫花桔梗苗木從培養(yǎng)瓶中取出后，將根部多余培養(yǎng)基用清水清洗干凈防止雜菌和蚊蟲(chóng)滋生。然后將白花桔梗和紫花桔梗組培苗木移栽到(草炭:蛭石 =1:1)育苗盤中，土壤整平，以株距6cm×6cm進(jìn)行栽培。栽完后放在室內(nèi)，放置在防曝曬、遮陰、保暖的溫室內(nèi)，并保持溫室內(nèi)濕度適當(dāng)。晚間溫度過(guò)低適當(dāng)保溫，控制溫度在（25±1）℃，保持移栽溫室的濕度在 80%～90%范圍內(nèi)?；|(zhì)保持濕潤(rùn)無(wú)積水，每周噴一次除菌劑，注意通風(fēng)。

2.7 脯氨酸含量的檢測(cè)

稱取白花桔梗和紫花桔梗材料各1g，剪碎，用移液槍準(zhǔn)確吸取5%TCA2mL和微量石英砂，研磨至均勻狀態(tài)，繼續(xù)加溶液進(jìn)一步研磨，將研磨均勻的桔梗材料置于離心管離心，取離心后上清液做為樣品提取液。用移液槍準(zhǔn)確吸取離心的桔梗材料上清液2mL(以蒸餾水為對(duì)照品)，用移液槍準(zhǔn)確吸取配置好的TBA溶液2mL，搖至均勻。將試管放入沸水浴中煮沸后，取出冷卻，置于離心機(jī)中高速離心15min，轉(zhuǎn)速3000r/min，取上清液加入比色皿中于波長(zhǎng)為532nm、600nm和450nm處測(cè)其吸光值，通過(guò)計(jì)算得出脯氨酸檢測(cè)值。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)基的篩選

由表1可知，不同桔梗在同種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況大致相同，而同種桔梗在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況差別很大，其中白花桔梗的發(fā)芽率為64%～82%，紫花桔梗的發(fā)芽率為47%～84%。培養(yǎng)在1/2MS培養(yǎng)基中的桔梗發(fā)育率最好，白花桔梗的發(fā)育率為82%，紫花桔梗的發(fā)芽率為84%，其生長(zhǎng)狀況良好，培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基中的桔梗發(fā)芽率次之，分別為70%和71%,其生長(zhǎng)狀況一般，其他培養(yǎng)基培養(yǎng)的桔梗發(fā)芽率均低于70%，生長(zhǎng)狀況較差。所以，1/2MS培養(yǎng)基比較適合桔梗的培養(yǎng)，因此，以1/2MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基模型進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)。

表1 白花和紫花桔梗在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

3.2 不同生長(zhǎng)激素對(duì)誘導(dǎo)愈傷率的影響

表2是正以最佳培養(yǎng)基1/2MS作為養(yǎng)基體系，加入生長(zhǎng)激素NAA和6-BA，進(jìn)行愈傷組織的處理培養(yǎng)。由表可知，相同濃度的激素處理的誘導(dǎo)愈傷率總體表現(xiàn)為：紫花桔梗＞白花桔梗，說(shuō)明紫花桔梗對(duì)NAA和6-BA激素更敏感；不同濃度的NAA和6-BA對(duì)桔梗誘導(dǎo)愈傷率的結(jié)果不同，其中白花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率為60.00%～86.67%，紫花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率66.67%～90.00%。 0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的桔梗誘導(dǎo)數(shù)較高，其中白花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率達(dá)到86.67%，紫花桔梗的誘導(dǎo)愈傷率達(dá)到90.00%；0.2mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的紫花桔梗誘導(dǎo)數(shù)次之，誘導(dǎo)愈傷率達(dá)到80.00%，0.5mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA濃度處理的桔梗誘導(dǎo)愈傷率普遍偏低，白花的誘導(dǎo)愈傷率低至60.00%，紫花的誘導(dǎo)愈傷率低至66.67%。

表3 不同的鹽在不同濃度下對(duì)桔梗成活率的影響

表2 培養(yǎng)基中不同濃度的NAA和6-BA對(duì)誘導(dǎo)愈傷率的影響

3.3 不同鹽濃度及種類對(duì)桔梗成活率的影響

在以1/2MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)體系中，0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA濃度的培養(yǎng)基中得到的桔梗苗木，愈傷組織接種到分別添加了0、2.5、5.0mg/L氯化鈉、硫酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉培養(yǎng)基中進(jìn)行鹽脅迫處理。由表2可知，白花桔梗和紫花桔梗的成活率隨著鹽濃度的不斷增加呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。在鹽濃度為0mg/L時(shí)，桔梗的成活率在 80.33%～83.33%之間，長(zhǎng)勢(shì)良好；在鹽濃度為 2.5mg/L時(shí)，桔梗的成活率在 72%～76%之間，長(zhǎng)勢(shì)一般；在鹽濃度為 5.0mg/L時(shí)，桔梗的成活率在61%～69%之間，長(zhǎng)勢(shì)較差。

不同的鹽處理的培養(yǎng)基中桔梗的成活率不同，在濃度為2.5 mg/L的培養(yǎng)基中，桔梗的成活率表現(xiàn)為：氯化鈉＞碳酸鈉＞碳酸氫鈉＞硫酸鈉；在濃度為5 mg/L的培養(yǎng)基中，桔梗的成活率表現(xiàn)為：碳酸鈉＞碳酸氫鈉＞氯化鈉＞硫酸鈉。

不同鹽類脅迫對(duì)組培苗的成活率隨鹽濃度的增大而降低這一現(xiàn)象會(huì)因繼代次數(shù)的增加而減弱，待組培苗生長(zhǎng)到一定的高度進(jìn)行移栽，移栽到(草炭:蛭石=1:1)育苗盤中，土壤整平，以株距6cm×6cm進(jìn)行栽培，就可以得到抗鹽性較高的組培苗。

3.4 鹽脅迫對(duì)桔梗中脯氨酸含量的影響

植物體內(nèi)脯氨酸的含量的大量積累是由于土壤中較高的鹽濃度所導(dǎo)致，游離的氨基酸在植物體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)滲透壓，維持細(xì)胞膨壓。表3是不同的鹽在不同濃度下對(duì)桔梗脯氨酸含量的影響，在鹽濃度為0mg/L時(shí)，白花桔梗中的脯氨酸含量在0.82～1.34mg/kg之間，紫花桔梗中的脯氨酸含量在0.89～1.19 mk/kg之間；在鹽濃度為2.5mg/L時(shí)，白花桔梗中的脯氨酸含量在4.55～6.22mg/kg之間，紫花桔梗中的脯氨酸含量在4.38～5.62mk/kg之間；在鹽濃度為5.0mg/L時(shí)，白花桔梗中的脯氨酸含量在9.43～10.32mg/kg之間，紫花桔梗中的脯氨酸含量在9.32～9.82 mk/kg之間。因此，隨著鹽濃度的增大，桔梗中的脯氨酸含量顯著增多，桔梗對(duì)環(huán)境中鹽的抵抗能力增強(qiáng)。

表4 不同鹽濃度處理的桔梗中的脯氨酸含量

試驗(yàn)結(jié)果表明白花桔梗和紫花桔梗的最適培養(yǎng)基是1/2MS，最適的誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基是1/2MS+0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA，誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基中加入不同濃度的鹽進(jìn)行抗鹽篩選，這種抗鹽性具有一定程度的穩(wěn)定性，從而培養(yǎng)出能夠更好的適應(yīng)環(huán)境變化的桔梗品種。

鹽濃度對(duì)桔梗發(fā)育率和生長(zhǎng)的影響一些學(xué)者持有不同的觀點(diǎn)，一般認(rèn)為在鹽成分誘導(dǎo)下，發(fā)芽的種子中可能存在一定的脅迫性的基因或特異的生理功能[4,5]，從而在環(huán)境中抵抗鹽脅迫，或者在鹽脅迫條件下抑制種子萌發(fā)，主要是由外界高滲透壓導(dǎo)致種子吸水不足而引起的發(fā)芽率較低[6]。張嬌[7]在氯化鈉模擬鹽脅迫對(duì)沙冬青種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響的研究中表明氯化鈉對(duì)種子的萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)均產(chǎn)生抑制作用；管清杰[8]在相關(guān)研究中也表明，植物在遭受干旱、高溫、高鹽的情況下細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被破壞，從而影響植株的生長(zhǎng)和發(fā)育。這與本文中的研究結(jié)果相一致。

植物在鹽脅迫條件下積累的主要滲透調(diào)節(jié)劑為脯氨酸，脯氨酸的含量是衡量植物抗逆性的主要生理指標(biāo)[9]。因?yàn)楦彼釋?duì)水具有很強(qiáng)的親和力，是一種可溶性的氨基酸，所以可以平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓、保護(hù)植物細(xì)胞和酶含量。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)植物受到鹽堿脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)性酶活性也會(huì)有不同程度增加，植物體內(nèi)的脯氨酸為代表的滲透協(xié)調(diào)物質(zhì)開(kāi)始大量產(chǎn)生[10]。張偉麗[11]等人的研究結(jié)果也表明，植物體內(nèi)脯氨酸含量隨不同鹽不同濃度的增加而增加,在一定程度下和鹽濃度成正相關(guān)。

4 結(jié)論

桔梗在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況表明，桔梗的最適培養(yǎng)基是 1/2MS，最適的誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)基是1/2MS+0.3mg/L NAA+0.3mg/L 6-BA；在不同鹽濃度脅迫的條件下，培養(yǎng)基中的鹽濃度越高，桔梗的發(fā)芽率越低，生長(zhǎng)狀況越差，但隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，桔梗的抗鹽能力增強(qiáng)；桔梗中脯氨酸的含量隨鹽濃度的增加而升高，也說(shuō)明鹽的存在能夠影響桔梗中氨基酸的含量，從而適應(yīng)環(huán)境的改變。