楊佳明，孟憲蘭，王丹萍，秦汝蘭*

（1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化134002；2.通化盛吉信生物科技股份有限公司，通化134002；3.通化市園藝研究所，通化134002）

柳蒿Artemisia integrifolia Linn.為菊科蒿屬多年生草本植物，又名萎蒿、白蒿、柳葉蒿、水蒿等[1]。廣泛分布于我國東北等地，柳蒿芽質(zhì)嫩，氣味獨特，幼嫩的地上部分可炒食或作湯菜，從北方達(dá)翰爾族人民開始，將其作為野菜廣泛食用。柳蒿中含有豐富的氨基酸、維生素和多糖，營養(yǎng)價值十分豐富[2～4]。化學(xué)成分研究表明，柳蒿芽中含有豐富的黃酮類成分，具有抗自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等作用[5～7]。

肝臟是機(jī)體內(nèi)以代謝功能為主的重要器官，具有解毒、調(diào)節(jié)糖、脂代謝平衡的作用[8]。近年來，隨著人們生活水平的提高以及生活環(huán)境的變化，病毒性肝炎、異源性肝損傷、肝纖維化及自身免疫性肝炎等肝臟疾病成為人類最常見的疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類健康[9]?；瘜W(xué)性肝損傷是由化學(xué)性肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷，這些化學(xué)物質(zhì)和藥物包括酒精、四氯化碳、半乳糖胺、撲熱息痛、抗結(jié)核藥物等均能造成肝細(xì)胞損傷[10]。四氯化碳作為經(jīng)典的肝損傷模型，可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好，能夠準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞的功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化，目前常作為建立肝損傷的模型試劑[11]。民間常用柳蒿全草治療感冒發(fā)燒、肝炎或肝硬化腹水等癥狀，具有很好的療效。國內(nèi)很多學(xué)者通過DPPH自由基清除實驗，OH-及O2-清除實驗，同時結(jié)合體內(nèi)實驗測定小鼠或大鼠血清、肝臟中SOD、GSH-Px及MDA等含量，揭示了柳蒿芽具有明顯的抗氧化作用[12～13]。

目前，柳蒿藥材的研究多集中于化學(xué)成分的報道，尚未見其質(zhì)量控制及保肝作用的研究。因此，筆者采用高效液相色譜法建立同時測定柳蒿中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素四種含量的方法，并采用四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型，探討柳蒿對小鼠肝組織的保護(hù)作用，為柳蒿芽資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

柳蒿藥材采于通化師范學(xué)院周邊，經(jīng)通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院于俊林教授鑒定為柳蒿 （Artemisia integrifolia Linn.）。

昆明種小鼠，清潔級，雄性，體重18～22 g，購于長春小鼠養(yǎng)殖基地。

安捷倫1260高效液相色譜儀 （美國安捷倫有限公司）；BS124S精密電子天平 （泰斯特儀器有限公司）；DNM-9602酶標(biāo)儀（美國 BioRad公司）；LR-16A低溫高速離心機(jī)（北京雷勃爾公司）。

綠原酸對照品（批號：110753-200413）、蘆丁對照品 （批號：1097-060918）、槲皮素對照品 （批號：100081-20097）均購于中國藥品生物制品檢定所，木犀草苷對照品（批號：MUST-13050601，）購于成都曼斯特生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、總抗氧化能力 （T-AOC）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、蛋白定量測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測試盒均購自南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯滴丸（浙江萬邦藥業(yè)有限公司）。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，乙醇為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：0.2%-磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，15% →20%B；5 ～35 min，20% →30%B；35 ～50 min，30%→48%B；50～60 min，48%→70%B）； 流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的配制

混合對照品溶液的制備：取綠原酸，蘆丁，木犀草苷，槲皮素對照品各適量，精密稱定，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成上述各待測成分質(zhì)量濃度分別為 1.624 3、0.411 3、0.130 5、0.043 6 mg·mL-1的混合對照品貯備液。

供試品溶液的制備：取柳蒿樣品粉末約1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 80%乙醇溶液，稱定其重量，超聲處理30 min，放置冷卻，用80%乙醇補(bǔ)足失去的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 柳蒿提取液的制備

柳蒿干燥粉末30g置于燒杯中，按照“2.2”項下方法制備樣品溶液，濃縮備用。

2.4 動物分組及處理

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為6組，每組10只，即空白組、模型組、陽性藥組（聯(lián)苯雙酯滴丸）、柳蒿提取液高劑量組、柳蒿提取液中劑量組、柳蒿提取液低劑量組。空白組與模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d，末次給藥后1 h，除空白組外，其余各組腹腔注射0.1%的CCl4橄欖油溶液0.2 mL/10 g，禁食，不禁水[14]。

2.5 生化指標(biāo)檢測

造模16 h后，戊巴比妥鈉麻醉后，采用眼球采血法取血，離心，上清液備用。采血后放血處死，取肝臟組織，制成10%的肝組織勻漿液，離心，上清液備用。按照試劑盒說明書方法分別測定血清中AST、ALT活力，肝組織中MDA含量及GSH-Px、T-AOC、T-SOD水平。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取 “2.2”項下混合對照品貯備液0.125，0.25，0.5，1，2 mL，分別置于 2 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性相關(guān)系數(shù)在0.999 8～0.999 9，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖見圖1，各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

圖1 混合對照品液相色譜圖

3.2 精密度實驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示儀器的精密度。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素峰面積的RSD 分別為 1.89%，0.81%，0.93%，1.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性實驗

取 “2.2”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 小時后進(jìn)行分析，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.26%，1.33%，0.88%，1.47%，表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 重復(fù)性實驗

取樣品適量，按“2.2”項下方法制成6份供試品溶液進(jìn)樣分析，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示方法的重復(fù)性。結(jié)果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.51%，1.06%，1.59%，1.04%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的柳蒿藥材粉末1 g，5份，加入一定量的綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素對照品混合液，制成供試品溶液進(jìn)樣分析?；厥章蕦嶒灲Y(jié)果見表2，表明實驗方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收率實驗（n=5）

3.6 樣品含量測定

取三批樣品各適量，制備供試品溶液，進(jìn)行分析，記錄各對照品峰面積并計算含量，結(jié)果見表3，液相色譜圖見圖2。

表3 樣品含量測定結(jié)果

圖2 柳蒿樣品液相色譜圖

3.7 柳蒿提取液對四氯化碳致肝損傷小鼠血清AST、ALT影響

由表4可以看出，與空白組相比，模型組小鼠血清 AST、ALT 水平顯著升高（P＜0.01），表明小鼠急性肝損傷模型制備成功。與模型組比較，柳蒿提取液高、中劑量組小鼠血清AST活性明顯降低 （P＜0.05；P＜0.01），且存在濃度依賴性。柳蒿提取液高劑量組血清ALT活性明顯降低（P＜0.05），實驗結(jié)果表明柳蒿提取液對四氯化碳致小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

表4 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和 ALT 活力的影響（，n=10）

表4 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和 ALT 活力的影響（，n=10）

*表示與模型組比較，P＜0.05；**表示與模型組比較，P＜0.01；## 表示與空白組比較，P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） AST(U/L) ALT(U/L)空白組 - 19.020±3.183 11.143±1.227模型組 - 48.148±2.844## 41.370±1.605##聯(lián)苯雙酯組 100 39.773±1.675** 35.855±2.785**高劑量組 200 40.963±3.379** 37.553±3.357*中劑量組 100 42.228±4.195* 39.225±1.603低劑量組 50 44.998±4.065 40.100±1.812

3.8 柳蒿提取液對四氯化碳致肝損傷小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA 的影響

由表5數(shù)據(jù)可知，與空白組相比，模型組小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平顯著降低，而肝組織中MDA含量顯著增加（P＜0.01），表明小鼠急性肝損傷造模成功。與模型組相比，柳蒿提取液高劑量組小鼠肝組織中T-SOD水平顯著增加 （P＜0.01），柳蒿提取液高劑量組小鼠肝組織中T-AOC水平顯著增加（P＜0.05），柳蒿提取液高劑量組、中劑量組小鼠肝組織中 GSH-Px水平顯著增加（P＜0.05；P＜0.01），柳蒿提取液高劑量組、中劑量組小鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P＜0.05；P＜0.01），實驗結(jié)果表明柳蒿提取液對四氯化碳致小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

表5 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA的影響(，n=10）

表5 柳蒿提取液對CCl4致肝損傷小鼠肝組織中T-SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA的影響(，n=10）

* 表示與模型組比較（P＜0.05）；## 表示與空白組比較（P＜0.01）；** 表示與模型組比較（P＜0.01）

組別 劑量（mg/kg） T-SOD(U/mg) T-AOC(U/mg) GSH-Px(μmol/g) MDA(μmol/g)空白組 - 389.377±4.021 3.068±0.122 165.102±2.667 5.498±0.224模型組 - 254.514±2.096## 1.366±0.070## 114.410±1.008## 9.209±0.152##聯(lián)苯雙酯組 100 267.389±8.131** 1.683±0.153** 118.030±1.542** 6.065±0.111**高劑量組 200 265.151±6.788** 1.583±0.153* 117.990±1.084** 8.619±0.102**中劑量組 100 261.775±2.239 1.508±0.050 117.237±0.703* 8.821±0.122*低劑量組 50 258.177±3.860 1.452±0.047 114.659±0.857 9.061±0.362

4 討論

課題組考察了超聲提取及加熱回流兩種提取方法，同時分別考察了不同提取溶劑（甲醇、80%乙醇、50%甲醇、50%乙醇）對提取效果的影響，以色譜峰個數(shù)及含量為指標(biāo)，最終確定80%乙醇溶液超聲提取30 min制備供試品溶液。此外，考察了Zorbax SB-C18、Kromasil C18及Inertsil ODS-3色譜柱對樣品分離結(jié)果，表明Zorbax SB-C18和Kromasil C18色譜柱分離效果較差，色譜基線漂移嚴(yán)重，而Inertsil ODS-3色譜柱各成分分離效果好，基線平穩(wěn)。因此，色譜柱選擇Inertsil ODS-3。

CCl4肝損傷模型常用來研究保肝、護(hù)肝藥物的藥效及其作用機(jī)制。對于CCl4引起的肝損傷機(jī)制存在多種意見，但都一致公認(rèn)，自由基的形成及引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)，能夠造成肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞與功能的完整性，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ALT、AST等酶溢出[15]。目前，在抗肝臟疾病的藥物研究中，各種黃酮類化合物對化學(xué)性肝損傷、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷等均有不同程度的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用與黃酮化合物清除自由基、抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等有著密切的關(guān)系。

血清中ALT和AST活性變化，常用來反映CCl4造成急性肝損傷的程度。AST活性增高，提示肝細(xì)胞線粒體受損傷；ALT活性增高，提示肝細(xì)胞膜破壞和細(xì)胞膜通透性增加[16]。本實驗結(jié)果顯示，柳蒿總黃酮高劑量組和中劑量組小鼠肝細(xì)胞損傷程度明顯減少，血清ALT、AST水平顯著低于CCl4模型損傷組，且具有劑量依賴性，提示柳蒿總黃酮具有保護(hù)肝細(xì)胞膜，對抗肝損傷的作用。

體內(nèi)活性氧的過度激活、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的引發(fā)和持續(xù)是肝細(xì)胞損傷的重要病理基礎(chǔ)之一[17]。MDA常用作脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，其含量反映了組織過氧化的損傷程度[18]；SOD作為抗氧化酶，能清除體內(nèi)自由基、抑制自由基反應(yīng)，是抗氧化的第一道防線[19]；GSH-Px是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，能特異性地清除機(jī)體活性氧，減輕和阻止活性氧的過氧化作用，是機(jī)體重要的抗氧化劑[20]。本實驗結(jié)果表明，模型組小鼠肝臟SOD抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化水平升高，表明急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞存在一定程度的損傷和氧化應(yīng)激。柳蒿總黃酮可改善肝臟氧化應(yīng)激狀況，能夠抑制肝組織中MDA升高而減輕肝臟損傷程度。柳蒿總黃酮給藥組小鼠肝組織SOD、GSH-Px、T-AOC活性顯著提高，表明其具有增強(qiáng)肝臟抗氧化能力的作用。

綜上所述，本方法操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于柳蒿藥材中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、槲皮素含量的同時測定。此外，柳蒿具有保肝活性，其機(jī)理可能是通過抑制自由基脂質(zhì)過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，降低血清ALT和AST兩種酶的活性而發(fā)揮保肝作用。本研究為柳蒿資源的充分開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù).