吳祥慶 余燾 吳明媛 黃國秋 楊姝麗

摘要：軟骨藻酸（DA）是一種由擬菱形藻屬硅藻產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，可累積在貝類體內(nèi)，食用受軟骨藻酸污染的貝類產(chǎn)品可引起記憶喪失、眩暈、昏迷甚至死亡等癥狀。研究建立了貝類產(chǎn)品中軟骨藻酸的液相色譜-高分辮質(zhì)譜檢測方法。以牡蠣和文蛤為研究對象，樣品經(jīng)甲醇提取、采用QuEChERS凈化，經(jīng)Hypersil GOLD C₁₈色譜柱分離，乙腈和2mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）為流動相梯度洗脫，正離子全掃描+數(shù)據(jù)依賴二級掃描，提取一級譜圖中準(zhǔn)分子離子精確質(zhì)量數(shù)定量，二級質(zhì)譜圖中特征離子精確質(zhì)量數(shù)定性。結(jié)果表明，軟骨藻酸在6min內(nèi)出峰，定量限0.01mg/kg，在25～500μg/L線性良好，R²=0.9998，回收率為90.5%～106.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于6.0%（n=6）。該方法簡單、快速、靈敏度高，能滿足貝類中軟骨藻酸的剛定。

關(guān)鍵詞：貝類;軟骨藻酸;高分辨質(zhì)譜

中圖分類號：O657.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0159-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.034

軟骨藻酸（Domoic acid，DA）是一種興奮性神經(jīng)毒素。軟骨藻酸由硅藻門的擬菱形藻屬和菱形藻屬產(chǎn)生，1958年首次從日本鹿兒島縣的大型藻類樹枝軟骨藻中分離出。貝類可富集藻類產(chǎn)生軟骨藻酸，具有較強(qiáng)的耐受力。而軟骨藻酸經(jīng)食物鏈富集后，可引起哺乳動物較嚴(yán)重的中樞神經(jīng)損害。軟骨藻酸具有熱穩(wěn)定性，一般的烹飪過程并不能破壞軟骨藻酸的毒性。人們食用含軟骨藻酸的貝類，可引起記憶喪失、眩暈、昏迷甚至死亡等癥狀。根據(jù)中毒癥狀，軟骨藻酸也被命名為失憶性貝毒。由軟骨藻酸引起的中毒沒有較好的療法，無法完全恢復(fù)受損的海馬結(jié)構(gòu)或空間記憶能力。1987年加拿大愛德華王子島東海岸發(fā)生因食用軟骨藻酸污染的紫貽貝中毒事件，造成3人死亡，100多人中毒，其中12人病愈后記憶喪失長達(dá)18個月。研究發(fā)現(xiàn)，貝類中軟骨藻酸含量達(dá)到40mg/kg可引起中毒，150mg/kg時有致命危險。產(chǎn)毒藻擬菱形藻廣泛分布于全球海水中，中國沿海也有報道，對貝類產(chǎn)品食用安全的威脅不容忽視[1-5]。

檢測貝類中軟骨藻酸的方法主要有小鼠生物法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、液相色譜法等[6-10]。其中液相色譜法應(yīng)用最廣，但是背景干擾大、靈敏度較低、選擇性不高。液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法具有高選擇性和高靈敏度的優(yōu)點[11-16]，本研究采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜對貝類中軟骨藻酸進(jìn)行檢測，能夠獲得目標(biāo)物的一級、二級精確質(zhì)量數(shù)質(zhì)譜圖，具有很好的定性分析和定量檢測效果。由于貝類樣品基質(zhì)復(fù)雜，本研究采用QuEChERS技術(shù)對提取液進(jìn)行凈化，降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了樣品分析效率，為軟骨藻酸的監(jiān)測提供了技術(shù)支持，為貝類產(chǎn)品食用安全提供了可靠保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

U3000液相色譜，美國賽默飛世爾公司Q Exae-live四極桿一靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾公司;HM100均質(zhì)器，北京格瑞德曼公司;Centrifuge 58048離心機(jī)，德國艾本德公司;旋渦混合器，美國Talboys公司;Synergy純水儀，美國密理博公司。

標(biāo)準(zhǔn)品DA（103.4±3.4μg/mL）、CRM-DSP-Mus購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所;甲醇、乙睛，色譜純，美國賽默飛世爾公司;甲酸，色譜純，美國Sigma公司;試驗用水由純水儀制備：C₁₈、GCB、PSA、MgSO₄基質(zhì)分散固相萃取填料，購自上海安譜公司。

貝類產(chǎn)品為近江牡蠣、文蛤，采自欽州七十二涇、大風(fēng)江貝類養(yǎng)殖區(qū)，實驗室-18℃保存。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 Hypersil GOLD C₁₈色譜柱（1.9μm，2.1mm×100mm）。流動相：乙腈（A），2mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）（B）。梯度洗脫：0～1min，30% A：1～3min 30%A～50% A：3～4min 50%A：4.1～6min 30% A。流速0.2mL/min，進(jìn)樣體積5μL，柱溫40℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI）;掃描方式為正離子，一級全掃描+數(shù)據(jù)依賴二級掃描;噴霧電壓3200V;鞘氣流量40Arb;輔助氣流量10Arb;離子傳輸管溫度320℃;一級掃描分辨率70000;二級掃描分辨率17500，歸一化碰撞能量20、40、60eV。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 用清水洗凈貝類外殼，切斷閉殼肌，打開外殼，用純水沖洗泥沙等異物，取除外殼的全部肌肉和內(nèi)臟作為試樣，瀝干后均質(zhì)。

1.3.2 樣品提取、凈化準(zhǔn)確稱取2.00g（精確到0.01g）樣品于50mL離心管中，加入9mL甲醇，渦旋混勻0.5min，超聲提取10min，8000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，殘渣再用9mL甲醇重復(fù)提取1次，離心后合并上清液，加甲醇至20mL。加入1g MgSO₄、150mg C₁₈、150mg GCB，漩渦混合0.5min，8000r/min離心5min，取10mL上清液于50℃下氮吹至近干，用80%甲醇定容至1mL，漩渦混合0.5min，過0.22μm濾膜，待儀器分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

軟骨藻酸分子式為C₁₅H₂₁NO₆，選擇正離子模式下強(qiáng)度最高的[M+H]⁺作為定量離子，精確質(zhì)量數(shù)理論值為312.14416。當(dāng)[M+H]⁺強(qiáng)度達(dá)到8×10⁴則觸發(fā)二級掃描，軟骨藻酸強(qiáng)度最高的二級碎片離子為[M-HCOOH+H]⁺，精確質(zhì)量數(shù)為266.13868，實際測定值為266.13836，偏差0.0012‰，二級質(zhì)譜見圖1。通過高分辨質(zhì)譜獲得母離子和子離子識別點分別為2IN和2.5IPs，因此只需要獲得1個母離子和1個子離子，就能滿足對目標(biāo)化合物4個識別點的確證要求。

提取一級全掃描譜圖中[M+H]⁺的精確質(zhì)量數(shù)312.14416定量，二級質(zhì)譜中碎片離子[M-HCOOH+H]⁺定性。在相同儀器條件下，樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間相對偏差在士5%以內(nèi)，且檢測到[M+H]⁺、[M-HCOOH+H]⁺的精確質(zhì)量數(shù)與理論值相對偏差小于0.005‰，可確定為軟骨藻酸陽性樣品。

2.2 色譜條件的選擇

研究選用C₁₈色譜柱，用乙腈和2mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸）進(jìn)行梯度洗脫，在“1.2.1”的色譜條件下，軟骨藻酸在6min內(nèi)出峰，分析時間短，峰形尖銳，靈敏度高（圖2）。

2.3 樣品提取、凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 樣品提取條件的優(yōu)化本研究根據(jù)軟骨藻酸的性質(zhì)及相關(guān)文獻(xiàn)資料[17-19]，通過比較提取前、后加標(biāo)的回收率，考察了用甲醇、50%甲醇、水的提取率。結(jié)果表明，3種提取劑的提取率均能達(dá)到90%以上。由于甲醇提取液有利于QuEChERS凈化及后續(xù)濃縮，因此本研究采用甲醇作為提取劑。

2.3.2 樣品凈化條件的優(yōu)化 貝類樣品中含有大量脂肪、蛋白質(zhì)和色素，基質(zhì)效應(yīng)大且易污染質(zhì)譜，需要對提取液進(jìn)行凈化。QuEChERS是一種分散固相萃取技術(shù)，將固相萃取吸附劑顆粒分散在樣品萃取液中，利用吸附劑與基質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)達(dá)到凈化目的，廣泛應(yīng)用于藥物殘留檢測[20，21]。本研究通過在基質(zhì)提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后，再添加不同固相萃取吸附劑凈化，比較了C₁₈、GCB、PSA3種常用凈化劑的效果。由于軟骨藻酸是酸性物質(zhì)，PSA為堿性吸附劑，對軟骨藻酸吸附強(qiáng)，因此回收率較低。單獨(dú)使用C₁₈固相萃取劑對色素凈化效果一般;添加GCB后色素凈化效果較好，回收率在80%以上。最終確定2g樣品中加入150mg C₁₈、150mg GCB和1g MgSO₄。

2.4 線性范圍和檢出限

為減少凈化不完全帶來的基質(zhì)效應(yīng)，本研究使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。取空白基質(zhì)樣品，按“1.3.1”樣品處理方法制得基質(zhì)溶液，在基質(zhì)溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為25、50、100、250、500μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2”儀器條件上機(jī)測定。以被測組分的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。在25～500μg/L線性良好，R²為0.9998。按照母離子信噪比（S/N）=3、信噪比（S/N）=10確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。DA檢出限為0.003mg/kg，定量限為0.01mg/kg，該方法完全可以滿足貝類毒素日常檢測的需要。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

歐盟第853/2004號法規(guī)規(guī)定軟骨藻酸總安全限量值為20mg/kg。對存在最高殘留限量（MRL）的物質(zhì)，加標(biāo)回收試驗一般選擇定量限（LOQ）、MRL和2MRL 3個濃度水平進(jìn)行。本研究選擇未檢出軟骨藻酸的牡蠣和文蛤樣品作為基質(zhì)空白樣品，分別添加0.01、20、40mg/kg 3個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。每個濃度水平做6個平行樣，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該方法的回收率和重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

通過QuEChERS技術(shù)結(jié)合液相色譜一高分辨質(zhì)譜，能夠有效凈化貝類樣品基質(zhì)中的各種雜質(zhì)，快速測定貝類產(chǎn)品中軟骨藻酸毒素。該方法簡單快速，靈敏度高，線性良好，回收率、精密度均能滿足貝類產(chǎn)品中軟骨藻酸毒素的限量要求。

參考文獻(xiàn)：

[1]王生福，楊傲傲，劉華雪，等.擬菱形藻軟骨藻酸產(chǎn)生影響因素及檢測方法研究進(jìn)展[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2019.9（3）：34-44.

[2]劉恒.痕量軟骨藻酸貝毒的高靈敏分析技術(shù)研究及應(yīng)用[D].福州：福州大學(xué)，2017.

[3]王九明，陳軍輝，何秀平，等.基于固相萃取膜盤技術(shù)分離富集海水中軟骨藻酸[J].分析化學(xué)，2019，47（7）：1075-1081.

[4]阮雯，紀(jì)煒煒，岳冬冬，等.貝類生物毒素研究進(jìn)展[J].漁業(yè)信息與戰(zhàn)略，2017，32（4）：276-280.

[5]王茜，程金平，高利利，等.記憶缺失性貝毒軟骨藻酸的污染現(xiàn)狀及檢測技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（26）：16070-16073.

[6]高治臭，林鄭忠，陳曉梅，等.貝類產(chǎn)品中軟骨藻酸的HPLC檢測方法[J].集美大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，20（4）：255-259.

[7]劉淑娟，趙曉祥，王茜，等.軟骨藻酸快速檢測方法技術(shù)研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2014，32（2）：10-14.

[8]李芳，李雪梅，李獻(xiàn)剛，等.貝類毒素檢測方法研究概況[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（23）：184-186.

[9l顧佳萍，袁濤.赤潮毒素軟骨藻酸檢測方法研究進(jìn)展[J].洋通報，2010，29（4）：472-477.

[10]衛(wèi)鋒，程日方，宮靜宏，等.高效液相色譜法測定貝類中的軟骨藻酸[J].色譜，2001（3）：248-250.

[11]趙芮，劉磊，劉麗，等.酶聯(lián)免疫吸附法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析海洋生物中記憶缺失性貝毒[J]分析試驗室，2015，34（8）：882-885.

[12]洪專，張怡評，陳偉珠，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿和尿液中記憶喪失性貝毒軟骨藻酸[J].分析科學(xué)學(xué)報，2014，30（3）：319-322.

[13]陳燕清，陳舜勝，于慧娟，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蝦夷扇貝和長牡蠣中軟骨藻酸的殘留[J].分析試驗室，2010，29（12）：21-24.

[14]宋琍琍，張海琪，侯鏡德，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定貝類毒素軟骨藻酸的殘留[J].水產(chǎn)學(xué)報，2008，32（6）：950-956.

[15]衛(wèi)鋒，趙守成，李大志.液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法測定貝類中軟骨藻酸[J].分析測試學(xué)報，2004（S1）：220-222.

[16]方曉明，衛(wèi)峰，范祥，等.液相色譜/四極桿-飛行時間質(zhì)譜測定失憶性貝毒的研究[J].分析測試學(xué)報，2004（S1）：240-241.

[17]王蟬，趙永拓，彭心婷，等.QuEChERS法聯(lián)合高效液相色譜法快速檢測扇貝中的軟骨藻酸[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，6（1）：72-77.

[18]柴繼業(yè)，王琳，趙巧靈，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定貝類產(chǎn)品中脂溶性貝類毒素[J].寧波大學(xué)學(xué)報（理工版），2018，31（3）：65-71.

[19]吳海燕，郭萌萌，趙春霞，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法篩查原多甲藻酸毒素及其代謝產(chǎn)物[J].色譜，3016，34（4）：401-406.

[20]劉青，曾廣豐，王志元，等.QuEChERS凈化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用貝類產(chǎn)品中4種脂溶性貝類毒素[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31（12）：338-344.

[21]曾廣豐，劉青，王志元，等.QuEChERS法結(jié)合高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜測定食用貝類產(chǎn)品中4種脂溶性貝類毒素[J].食品工業(yè)科技，2015，36（21）：289-294.

收稿日期：2020-02-18

基金項目：廣西重點研發(fā)計劃項目（桂科AB16380290）

作者簡介：吳祥慶（1977-），男，廣西玉林人，副研究員，主要從事水產(chǎn)品檢測技術(shù)研究工作，（電話）13878602255（電子信箱）wuxiangqing19@163.com;通信作者，楊妹麗，高級工程師，碩士，主要從事水產(chǎn)品檢測技術(shù)研究工作，（電話）13878178627（電子信箱）13878178627@qq.com。