何天鵬,趙 鐳,鐘 葵,史波林,崔 瑩,張璐璐,劉龍?jiān)?謝 苒,汪厚銀

(中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院食品與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化研究所,北京 102299)

醬油作為調(diào)味品存在歷史悠久,早在周朝就有制醬的記載。醬油經(jīng)過3000多年的傳播及演變,已經(jīng)成為東亞地區(qū)的傳統(tǒng)調(diào)味料之一,并且因其濃郁的鮮味及獨(dú)特的香氣,在西方國家也越來越受歡迎[1]。在發(fā)酵過程中,原料、鹽水濃度、微生物、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度等都會影響醬油發(fā)酵的風(fēng)味[2-3]。微生物的代謝在醬油發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用,其中酵母菌的存在更是為醬油的增香、增鮮做出了不可替代的貢獻(xiàn)。醬油的風(fēng)味是在發(fā)酵過程中緩慢積累形成的,因此在醬油發(fā)酵過程中,耐鹽性生香酵母菌如魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)的添加,有助于醬油中總酸、總酯及酒精含量的提高,使得醬油的醇香和酯香更加濃郁,風(fēng)味更加完善[4-6]。

孟琦等人研究表明揮發(fā)性硫醇的生成與酵母菌的代謝至關(guān)重要[7]。此外,酵母菌的加入,可以明顯提高醬油中酮類物質(zhì)的含量,而酮類物質(zhì)對“蘑菇味”有著極大貢獻(xiàn),因此酵母菌是醬油風(fēng)味形成的關(guān)鍵因素之一;在醬油釀造過程中篩選出更具產(chǎn)香優(yōu)勢的酵母菌株已成為醬油釀造業(yè)的必然趨勢[8-10]。但篩選出的優(yōu)勢產(chǎn)香酵母菌是否適合醬油釀造的工業(yè)化生產(chǎn),如何鑒定分析其優(yōu)勢特點(diǎn),從而加以印證其產(chǎn)香優(yōu)勢,為目前醬油釀造行業(yè)亟待解決的問題。

固相微萃取(SPME)結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(GC-O/MS)技術(shù)在食品中的應(yīng)用已經(jīng)很普遍。與溶劑萃取、溶劑輔助蒸發(fā)萃取以及動(dòng)態(tài)頂空萃取相比,SPME不需溶劑、操作簡便、僅需少量樣品,實(shí)驗(yàn)過程中沒有副產(chǎn)物生成。因此,針對以上問題,本次研究采用SPME聯(lián)合GC-O/MS方法對醬油中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)行分離檢測。在通過RI(retention index)、MS及嗅聞結(jié)果對醬油樣品中香氣物質(zhì)定性分析的同時(shí),結(jié)合OAV(odor activity value)的計(jì)算,確定三種醬油中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。再通過將多維影響參數(shù)進(jìn)行降維,從而選取出最主導(dǎo)影響因素的PCA(principal component analysis)分析[11],對各醬油樣品中的香氣特點(diǎn)進(jìn)行分析,并結(jié)合感官實(shí)驗(yàn)加以佐證。本文通過測定不添加酵母菌、由AY型魯氏酵母菌、由T型魯氏酵母菌分別釀制的三種醬油樣品中風(fēng)味物質(zhì)組成,對比分析了由兩種魯氏酵母菌分別釀造醬油的風(fēng)味特點(diǎn),從而進(jìn)一步挑選出產(chǎn)香優(yōu)勢更佳的醬油釀造酵母菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AY醬油樣品(由AY型魯氏酵母菌發(fā)酵制得),T醬油樣品(由T型魯氏酵母菌發(fā)酵制得),空白樣品(不添加酵母菌發(fā)酵制得),兩種酵母菌均為魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomycesrouxii),三種醬油樣品均采用高鹽稀態(tài)釀造工藝制得 由青島燈塔釀造有限公司提供;2-甲基-3-庚酮 色譜級,美國Sigma公司;正構(gòu)烷烴C7～C30色譜級,北京化學(xué)試劑公司;正己烷 色譜級,美國Fisher公司。

HH-1數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣針及三涂層萃取頭(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm 美國SUPELCO公司;7890A-7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 配有EI離子源及NIST 08數(shù)據(jù)庫,美國Agilent公司;Sniffer 9000嗅聞檢測器 瑞士Brechbuhler公司;毛細(xì)管柱:DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國J&W公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 量取10 mL醬油樣品于40 mL頂空瓶中,并加入1 μL濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮。將頂空瓶加蓋密封后,放置于55 ℃的恒溫水浴鍋中,平衡20 min后,插入3涂層固相微萃取進(jìn)樣針,推出吸附涂層,吸附40 min,等待GC進(jìn)樣[12]。

1.2.2 參數(shù)設(shè)定

1.2.2.1 色譜條件 以高純氦氣為載體,載氣流量為1.2 mL/min,分流比為5∶1。進(jìn)樣口溫度為250 ℃,解析5 min。DB-Wax(極性柱)升溫程序:40 ℃保持3 min;以3 ℃/min升至70 ℃,保持2 min;以10 ℃/min升至240 ℃,保持10 min;DB-5(非極性柱)升溫程序:40 ℃保持3 min;以5 ℃/min升至200 ℃;以10 ℃/min升至230 ℃,保持3 min。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(Electron impact,EI),電子能量70 eV,m/z掃描范圍40～500,離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度為280 ℃。

為了防止嗅聞人員鼻粘膜的干燥,濕空氣以30 mL/min的速度被供應(yīng)到嗅聞口。每組樣品進(jìn)行三次平行檢測。

1.2.3 定性與定量分析

1.2.3.1 定性方法 采用NIST 08數(shù)據(jù)庫比對;計(jì)算對應(yīng)化合物保留值(RI),并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留值及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行保留值比對;嗅聞口嗅聞、記錄化合物的香氣特征三種方法對兩種醬油樣品中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

化合物的保留值根據(jù)C7～C30正構(gòu)烷烴保留時(shí)間公式計(jì)算:

式中:n為C7～C30正構(gòu)烷烴的碳原子個(gè)數(shù),t1為Cn的保留時(shí)間,T為Cn+1的保留時(shí)間,t3為樣品中化合物的保留時(shí)間(t1≤t3≤T)。

1.2.3.2 定量方法 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)為內(nèi)標(biāo),并根據(jù)內(nèi)標(biāo)濃度計(jì)算樣品中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的濃度:

注:C1為目標(biāo)化合物的濃度,A1為目標(biāo)化合物的峰面積,C2為2-甲基-3-庚酮的濃度,A2為2-甲基-3-庚酮的峰面積[12-14]。

1.2.4 感官評價(jià) 針對醬油中各風(fēng)味特點(diǎn)制作相應(yīng)感官評價(jià)表格[15-17]。感官評價(jià)小組由8人(4男4女)組成,感官小組成員經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)品的嗅聞?dòng)?xùn)練,分別對三種醬油樣品的香氣以及滋味進(jìn)行感官評定。

表1 香氣強(qiáng)度等級打分表Table 1 Aroma intensity rating table

表2 滋味強(qiáng)度等級打分表Table 2 Taste intensity rating table

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,采用Microsoft Excel 2016繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣活性物質(zhì)分析

通過圖1醬油中香氣物質(zhì)種類的對比可以發(fā)現(xiàn),酵母菌的添加更有助于酵母菌中香氣物質(zhì)的形成。此外,AY型魯氏酵母菌可以產(chǎn)生更多種類的酯類、醇類、吡嗪類等化合物;T型魯氏酵母菌在產(chǎn)醛類物質(zhì)種類方面更具優(yōu)勢,而沒有添加酵母菌的空白組樣品,在香氣化合物生成方面則明顯不足,說明AY型和T型兩種魯氏酵母菌的添加,使得醬油中香氣物質(zhì)種類增多。

圖1 三種醬油樣品中化合物種類柱狀圖Fig.1 Spices of compounds in three kinds of soy sauce samples

通過對比圖2中三種醬油中各類香氣物質(zhì)的含量發(fā)現(xiàn),AY型魯氏酵母菌在醬油發(fā)酵過程中,可以產(chǎn)生較多含量的酯類、酚類、呋喃酮類及醛類化合物;而T型魯氏酵母菌在產(chǎn)醇類物質(zhì)方面具有優(yōu)勢。結(jié)合空白樣品中化合物含量可以看出,AY型魯氏酵母菌和T型魯氏酵母菌可以明顯提高釀造醬油中揮發(fā)性物質(zhì)含量。結(jié)合圖1、圖2可知,AY型魯氏酵母菌在產(chǎn)醬油中香氣物質(zhì)的種類及含量上較其他醬油樣品具有整體優(yōu)勢。

圖2 三種醬油樣品中化合物含量柱狀圖Fig.2 Contents of different species compounds in three soy sauce samples

酯類物質(zhì)特有的果香、花香、醇類物質(zhì)的甜香以及吡嗪類物質(zhì)特有的烤香,為醬油特有的香氣做出了巨大貢獻(xiàn)。圖2結(jié)果顯示,兩種樣品中醇類化合物含量皆是最高的。AY樣品中的酯類、酸類、呋喃酮類及吡咯類等香氣物質(zhì)的總含量皆高于T樣品。苯乙醇、糠醇、乙酸、HEMF、苯乙醛、2-乙?；量?-乙基愈創(chuàng)木酚等關(guān)鍵香氣化合物的含量在AY樣品中更多[1,18-19]。

通過對AY醬油樣品、T醬油樣品以及空白醬油樣品的分析,共檢測揮發(fā)性化合物130種,其中揮發(fā)性香氣化合物共58種,并將揮發(fā)性香氣物質(zhì)匯總至表3。AY型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油中:酯類11種、醇類12種、酸類2種、吡嗪類7種、呋喃酮類2種、醛類6種、吡咯類2種、酚類7種;T型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油中:酯類9種、醇類11種、酸類2種、吡嗪類5種、呋喃酮類2種、醛類7種、吡咯類2種、酚類7種;空白發(fā)酵醬油(空白)中:酯類6種、醇類6種、酸類2種、吡嗪類5種、呋喃酮類1種、醛類5種、酚類5種。

本次實(shí)驗(yàn)采用DB-Wax與DB-5兩種色譜柱對三種醬油樣品進(jìn)行揮發(fā)性香氣物質(zhì)檢測,并結(jié)合RI值與嗅聞結(jié)果對檢測到的化合物進(jìn)行更加準(zhǔn)確定性。其中,如異戊酸乙酯(果香)、辛醇(金屬、烤香)、2,3-二甲-5-乙基吡嗪(爆米花)、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪(熟土豆)、2-丙酰吡咯(烤肉、爆米花)等物質(zhì),因?yàn)楹枯^低,不能通過MS檢測得到,但卻可通過嗅聞結(jié)果和RI值對其進(jìn)行定性分析得到。

在表3中可以發(fā)現(xiàn),對醬油風(fēng)味起著至關(guān)重要的揮發(fā)性香氣物質(zhì),如1-辛烯-3-醇(蘑菇味)有助于醇厚感,2-甲基-1-丁醇(紅酒)、4-羥基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(焦糖)是醬油中最重要的香氣物質(zhì),3-甲基丁醛(杏仁)、苯乙醛(花香)、3-甲硫基丙醛(熟土豆)和2-甲氧基苯酚(煙熏)等化合物是日式醬油中主要的風(fēng)味物質(zhì),而酯類中的己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯;醇類中的丙醇、乙酸以及醛酮類等物質(zhì),分別賦予食物水果香、甜香等氣味,它們的共同作用為醬油提供了果香、焦香、花香、烤香、爆米花香等特征香氣[20-23]。

表3 GC-O-MS分析出的三種醬油中的香氣成分Table 3 Analysis of aroma components in two kinds of soy sauce by GC-O-MS

魯氏酵母菌主要作用于發(fā)酵前期,能夠代謝葡萄糖,形成高級醇,如異丁醇、異戊醇、甲硫醇、2-苯乙醇等關(guān)鍵香氣物質(zhì),這些物質(zhì)都是以α-酮酸為重要中間產(chǎn)物形成的[24-25]。高級醇通過脫羧形成,隨后還原相應(yīng)的α-酮酸。α-酮酸本身主要體現(xiàn)的兩個(gè)途徑中,一條途徑是氨基酸生物合成途徑,另一條是氨基酸的分解代謝途徑,即Ehrlich途徑[26]。在Ehrlich途徑中,α-酮酸通過消耗和隨后的細(xì)胞外氨基酸的脫氨基或轉(zhuǎn)氨基形成[27-28]。

由于在鹽水發(fā)酵期間存在非常高濃度的細(xì)胞外氨基酸,所以預(yù)計(jì)大部分高級醇通過Ehrlich途徑形成。此外,Ehrlich途徑也是甲硫醇(該物質(zhì)具有更加可接受的風(fēng)味)形成的唯一途徑[29-31]。而醬油中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)之一的4-羥基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)是由酵母菌磷酸戊糖途徑代謝獲得;酚類物質(zhì)主要來源于小麥麩皮,經(jīng)曲霉和特定酵母菌代謝后形成酚類物質(zhì)。與韓式醬油相比,本文中由AY型和T型魯氏酵母菌發(fā)酵的醬油樣品中含有更高含量的酯類、醇類等物質(zhì),并且本次的醬油樣品較之韓式醬油中含有更多種類的香氣物質(zhì)[32]。研究結(jié)果還顯示,本次研究的兩種酵母菌產(chǎn)生物質(zhì)的種類及含量優(yōu)于日本Shiro Shoyu的香氣物質(zhì)[33]。可以看出本文中的兩種魯氏酵母菌在各自的代謝途徑下,能夠積累更多的香氣物質(zhì),表明其在生成香氣物質(zhì)方面,具有一定優(yōu)勢。

2.2 OAV結(jié)合PCA分析

OAV(氣味活度值)計(jì)算方法為氣味化合物的濃度與該物質(zhì)的嗅聞閾值的比值,廣泛用于食品中關(guān)鍵風(fēng)味化合物的鑒定。一般認(rèn)定,當(dāng)化合物的OAV>1則對食品氣味有一定貢獻(xiàn),且OAV越大,其貢獻(xiàn)越大[35]。由表4可知,通過對醬油樣品中OAV的計(jì)算,發(fā)現(xiàn)AY酵母菌釀造醬油中的4-羥基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)、2/3-甲基丁醛及苯乙醛的OAV高于其他樣品的OAV值,T型魯氏酵母菌的1-辛烯-3-醇及3-甲硫基丙醛的OAV值高于其他樣品的OAV值。

表4 三種樣品中OAV>1化合物統(tǒng)計(jì)表Table 4 Statistical tables for OAV>1 compounds in three samples

由圖3可知,前兩個(gè)主成分的累計(jì)方差達(dá)到了84.379%,滿足主成分分析條件,三個(gè)樣品分布在坐標(biāo)的三個(gè)象限,說明因?yàn)椴煌湍妇募尤?樣品中各香氣物質(zhì)成分的組成和含量上有所區(qū)別,以三種樣品的坐標(biāo)顯示,AY型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油的香氣優(yōu)勢明顯強(qiáng)于T型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油。結(jié)合香氣成分的PCA分析,T型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油以熟土豆氣味為主,并伴有蘑菇香氣;AY型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油以甜香香氣為主,并伴有麥芽香氣;空白組樣品中則伴有可可粉和煙熏香氣。

圖3 三種醬油樣品及香氣物質(zhì)PCA分析圖Fig.3 PCA analysis of three kinds of soy sauce and aroma

結(jié)合表3與表4的結(jié)果可知,盡管OAV值的計(jì)算可以明確醬油中香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)度,但是,在結(jié)合嗅聞結(jié)果發(fā)現(xiàn),部分香氣物質(zhì)盡管沒能檢測到其含量,但依然可以嗅聞到相應(yīng)香氣特點(diǎn),如3-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、糠醇、苯乙醇、2,5-二甲基吡嗪以及4-乙基愈創(chuàng)木酚等。因此,OVA值結(jié)合嗅聞結(jié)果更能體現(xiàn)香氣物質(zhì)在醬油香氣上的貢獻(xiàn)度。

2.3 感官評價(jià)結(jié)果

由圖4可以看出,T樣品的整體香氣中,以酸味和熟土豆香氣較為突出;AY樣品的酒精香味及烤肉香氣等較為突出;空白(空白)組與其他兩組相比,在香氣感官評分方面較差,也間接說明酵母菌對醬油香氣的形成具有極大的貢獻(xiàn)作用。此外,結(jié)合圖3和圖4可以看出,香氣的感官評價(jià)結(jié)果與PCA分析的OAV>1的結(jié)果基本相符。圖5的滋味感官結(jié)果表明,T樣品中的咸味、酸味及后味都要強(qiáng)于其他兩組樣品,但AY樣品鮮味和甜味口感則更加優(yōu)越,而空白樣品在滋味感官上并不具有明顯特點(diǎn)。此外,根據(jù)感官結(jié)果顯示,AY樣品在香氣方面更加飽滿,滋味方面更加圓潤。

圖4 三種醬油香氣感官雷達(dá)圖Fig.4 Sensor radar diagram of three kinds of soy sauce aroma

圖5 三種醬油滋味感官雷達(dá)圖Fig.5 Sensory radar diagram of three kinds of soy sauce

3 結(jié)論

醬油在日常生活中有著不可替代的作用,也使得越來越多的研究集中在改善其品質(zhì)上。因?yàn)獒u油的發(fā)酵受到原料、微生物種類、微生物代謝、發(fā)酵條件以及加熱殺菌等因素的影響,所以成品醬油中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的組成和含量也會因此受到影響。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AY型魯氏酵母菌能夠代謝出更多種類的酯類、醇類及吡嗪類化合物,并且在產(chǎn)HEMF、苯乙醛、2-乙?；量?-乙基愈創(chuàng)木酚等關(guān)鍵香氣化合物方面具有優(yōu)勢,其整體香氣呈甜香及麥芽香;T型魯氏酵母菌能夠產(chǎn)出更高含量的乙醇、酯類及酚類化合物,其整體香氣呈熟土豆香氣。感官結(jié)果顯示,由AY型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油整體香氣更加飽滿,口感圓潤;由T型魯氏酵母菌發(fā)酵醬油整體香氣中酸味較為突出,有掩蓋其他香氣的趨勢。因此研究結(jié)果顯示,AY型魯氏酵母菌的整體產(chǎn)香效果優(yōu)于T型魯氏酵母菌的產(chǎn)香效果。因?yàn)獒u油的發(fā)酵過程屬于多菌種代謝過程,因此,將進(jìn)一步研究AY型魯氏酵母菌和T型魯氏酵母菌共同作用下,對醬油中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響,以便進(jìn)一步分析兩種醬油酵母菌對醬油中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響,從而為醬油發(fā)酵提供指導(dǎo)理論。