畢雪源，查曉明

(中國(guó)藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京 211198)

在含氧代謝過(guò)程中，需氧生物產(chǎn)生各種活性氧(ROS，reactive oxygen species)?；钚匝醢ǔ趸?O2·-)、臭氧(O3)、脂質(zhì)過(guò)氧自由基(ROO·)、單線態(tài)氧(1O2)、次溴酸/次溴酸鹽(HOBr / BrO-)、次氯酸/次氯酸鹽(HOCl / ClO-)、一氧化氮(NO)、羥基自由基(·OH)，過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO-)、過(guò)氧化氫(H2O2)等[1-3]。H2O2是最重要的活性氧家族之一，對(duì)許多生理和病理過(guò)程具有重要的調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，免疫防御機(jī)制，細(xì)胞凋亡，遷移和分化等過(guò)程[4-12]。在細(xì)胞中，H2O2主要是通過(guò)激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶復(fù)合物在線粒體中產(chǎn)生的，但也源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)和各種氧化酶[13-16]。重要的是，細(xì)胞內(nèi)不同濃度的H2O2會(huì)極大地影響其生物學(xué)功能。通常情況下，健康細(xì)胞中H2O2的生理濃度范圍為1到105nM[17]。H2O2的過(guò)量積累可能對(duì)身體有害，從而導(dǎo)致一系列疾病，例如癌癥，炎癥和細(xì)胞損傷[18-20]。低生理濃度的H2O2可以觸發(fā)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)氧化應(yīng)激。H2O2在生物系統(tǒng)中起著不可或缺的作用[21]。因此，有必要開發(fā)有效的方法來(lái)靈敏地檢測(cè)各種條件下H2O2的濃度和分布。

最近，已經(jīng)報(bào)道了許多檢測(cè)H2O2的方法，包括熒光標(biāo)記法、電化學(xué)傳感器、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、滴定法、色譜法、光檢測(cè)法[22-28]。其中，熒光標(biāo)記法具有更多的優(yōu)點(diǎn)，包括優(yōu)異的選擇性、良好的靈敏度、方便的應(yīng)用、低成本、實(shí)時(shí)和可視化的特點(diǎn)。因此，研究人員將注意力集中在開發(fā)用于對(duì)人類健康和臨床前診斷進(jìn)行H2O2成像的熒光探針上。近來(lái)，許多基于芳基硼酸酯或苯基硼酸氧化反應(yīng)的熒光探針已被設(shè)計(jì)用來(lái)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞和組織中的H2O2，因?yàn)樗鼈儗?duì)H2O2的選擇性性高于其他ROS。早在1957年，就在水溶液中研究了H2O2對(duì)芳基硼酸的傳感機(jī)制(圖1)。親核的H2O2進(jìn)攻親電的芳基硼酸酯形成不穩(wěn)定的中間體，該中間體水解后可定量生成苯酚和硼酸[29]。由于H2O2的功能在很大程度上取決于亞細(xì)胞區(qū)室。考慮到這些需求，設(shè)計(jì)并合成了一些具有細(xì)胞器靶向能力的H2O2熒光探針。

圖1 基于芳基硼酸酯官能團(tuán)的熒光探針對(duì)H2O2的識(shí)別機(jī)理

2 具有細(xì)胞器靶向的熒光探針研究進(jìn)展

線粒體是重要的細(xì)胞器，被認(rèn)為是活細(xì)胞中H2O2的主要來(lái)源[30-31]。因此，開發(fā)了線粒體靶向的H2O2探針，用于H2O2的定量分析。由于線粒體膜的電勢(shì)通常為-180 mV，帶有陽(yáng)離子的染料可以很容易地穿透線粒體膜，然后在其內(nèi)部積累[32]。帶正電的基團(tuán)，例如三苯基磷基團(tuán)(triphenylphosphonium，TPP)(圖2)，氮正離子和氧鎓離子(圖3)表現(xiàn)出優(yōu)異的線粒體靶向特征。2008年，Chang等人以帶正電的作為靶向基團(tuán)，設(shè)計(jì)了第一個(gè)線粒體定向的H2O2熒光探針1[33]。1能夠?qū)Ω鞣N哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體中H2O2的水平變化進(jìn)行成像，以及監(jiān)測(cè)到帕金森氏病的氧化應(yīng)激模型引起的H2O2水平升高。

Wong等人設(shè)計(jì)并合成了一種基于咔唑熒光團(tuán)和TPP的新型雙光子(two-photo，TP)熒光“開啟”探針2[34]，用于線粒體H2O2檢測(cè)。它不僅表現(xiàn)出在15分鐘內(nèi)的快速響應(yīng)和1.96 nM的低檢測(cè)限(limitof detection，LOD)，而且還具有比其他ROS更高的選擇性。共定位實(shí)驗(yàn)表明，2在HeLa細(xì)胞中選擇性定位于線粒體，Pearson共定位系數(shù)為0.925。2可以檢測(cè)深度為105 mm的細(xì)胞和組織中的H2O2，具有出色的成像能力。

圖2 基于三苯基磷的線粒體定位H2O2探針

在2019年，基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer，ICT)的熒光探針3被報(bào)道[35]，用于檢測(cè)線粒體H2O2，其熒光強(qiáng)度變化為120倍，斯托克斯位移(93 nm)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明探針3具有極好的線粒體靶向和檢測(cè)內(nèi)源性H2O2的能力，還可以監(jiān)測(cè)(m-chlorophenylhydrazone，CCCP)在線粒體定向凋亡過(guò)程中H2O2水平的變化。

TPP的毒性是生物學(xué)應(yīng)用關(guān)注的問(wèn)題，因此，相繼開發(fā)并應(yīng)用了其他具有氮正離子或氧鎓離子的靶向部分。Shao和他的同事提出了一種新穎的“打開”熒光探針4[36]，該探針引入了咔唑基團(tuán)作為熒光團(tuán)，對(duì)-頻哪醇硼芐基部分作為對(duì)H2O2的識(shí)別位點(diǎn)以及具有氮正離子的季銨化的喹啉單元，既是線粒體靶向載體，又是水溶性基團(tuán)。探針4表現(xiàn)出良好的水溶性，合適的靈敏度(LOD=40 nM)，高選擇性和在5分鐘內(nèi)對(duì)H2O2的快速響應(yīng)。探針4在細(xì)胞成像中具有線粒體靶向，可以成功地監(jiān)測(cè)HeLa細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性H2O2的水平變化。

Lin課題組開發(fā)了一種新穎的“關(guān)閉”熒光探針5[37]，該探針具有較大的斯托克斯位移(170 nm)。它實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的高度選擇性檢測(cè)。探針5顯示出優(yōu)異的線粒體靶向特性，并且可以在活的RAW 264.7細(xì)胞中感知外源性和內(nèi)源性H2O2。

Zhang等人構(gòu)建了一種新型的線粒體靶向比例型熒光探針6[38]，該探針由香豆素作為熒光團(tuán)和硼酸酯部分作為反應(yīng)位點(diǎn)組成。當(dāng)加入H2O2時(shí)，化合物6的發(fā)射比率(I535 / I640)表現(xiàn)出良好的線性。化合物6顯示出合適的靈敏度(LOD = 10 nM)，高選擇性。此外，該探針具有良好的線粒體靶向能力，可通過(guò)比例熒光成像用于監(jiān)測(cè)NRK細(xì)胞中的H2O2。

2018年，Song課題組利用ICT和激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT)機(jī)制的結(jié)合，設(shè)計(jì)并合成了一種用于H2O2的新型比例熒光探針7[39]。加入H2O2后，探針7表現(xiàn)出顯著的比例熒光變化(I594nm/ I666nm)，并且顯示出較大的斯托克斯位移變化(152nm)。此外，該探針顯示出優(yōu)異的線粒體靶向特性(Pearson共定位系數(shù)= 0.94)，并且可以檢測(cè)活HeLa細(xì)胞中的外源性和內(nèi)源性H2O2。

Tang等人在2018年開發(fā)了一種基于ESIPT機(jī)理的線粒體靶向的近紅外(near-infrared，NIR)發(fā)射熒光探針8[40]，用于比例檢測(cè)H2O2。該探針具有大的斯托克斯位移(357 nm)，對(duì)H2O2具有高選擇性和敏感性。在沒(méi)有H2O2的情況下，該探針在539 nm處顯示出弱發(fā)射帶。加入H2O2會(huì)導(dǎo)致539 nm處的發(fā)射消失，而新的發(fā)射帶以669 nm為中心增加。探針8的強(qiáng)度比(F669 / F539)與H2O2的濃度表現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性(R2=0.9941)。探針8是線粒體靶向的，已應(yīng)用于活A(yù)549細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性H2O2的成像。

在2020年，Huang及其同事提出了一種新型的比例熒光探針9，該探針可選擇性檢測(cè)活細(xì)胞中的線粒體H2O2[41]。將硼酸芳基酯直接與熒光團(tuán)通過(guò)簡(jiǎn)單的合成結(jié)合，即可構(gòu)建探針9。ICT機(jī)制被芳基硼酸酯與熒光團(tuán)直接偶聯(lián)所抑制。在加入H2O2之前，在395 nm激發(fā)時(shí)，9的發(fā)射波長(zhǎng)為493 nm。然而，在H2O2存在下，9在493 nm處的熒光發(fā)射紅移到562 nm，從而實(shí)現(xiàn)了比率檢測(cè)。9對(duì)H2O2表現(xiàn)出高度的選擇性和敏感性(LOD =0.33μM)，并且可以通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)CHO-K1細(xì)胞中的線粒體H2O2進(jìn)行雙通道熒光成像。

Zhou小組構(gòu)建了一個(gè)雙光子(two-photo,TP)NIR熒光探針(10)，可通過(guò)TP可視化細(xì)胞和組織中的線粒體H2O2[42]。10使用苯硼酸作為H2O2反應(yīng)部分，并使用氧鎓離子作為線粒體靶向單元。該探針可以高選擇性檢測(cè)H2O2，并且在665 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)105倍。10在TP激發(fā)(800 nm)下的活細(xì)胞線粒體H2O2和小鼠肝臟組織(深度50～170μm)進(jìn)行成像。

H2O2是最重要的ROS之一，在堿性環(huán)境中對(duì)蛋白質(zhì)，DNA，RNA和酶等生物分子具有更強(qiáng)的攻擊活性，并導(dǎo)致一系列疾病。 Lin組報(bào)告了第一個(gè)基于硼酸的比率型NIR熒光探針11，用于在堿性條件下檢測(cè)H2O2和在體內(nèi)對(duì)H2O2成像[43]。11在堿性緩沖液中具有比例熒光成像性能(I720nm / I660nm)和對(duì)H2O2的高選擇性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，11可以成功地成像HeLa細(xì)胞中的外源H2O2，并且可以對(duì)PMA刺激的巨噬細(xì)胞或EGF刺激的A431細(xì)胞中內(nèi)源性生成的H2O2成像。在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中，11可以對(duì)活體動(dòng)物中的H2O2進(jìn)行成像。

圖3 基于氮正離子或氧鎓離子的線粒體定位H2O2探針

越來(lái)越多的證據(jù)表明H2O2與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，尤其是在線粒體中。然而，在凋亡過(guò)程中，很少探索不同隔室中H2O2水平的協(xié)同變化，尤其是在兩個(gè)重要的細(xì)胞器：線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Cendoplasmic reticulum,ER)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Tang研究小組開發(fā)了兩種新型的細(xì)胞器特異性熒光探針，分別為12(圖3)和13(圖4)，可以分別檢測(cè)線粒體和ER中的H2O2[44]。12和13可以成功地對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體和ER中的內(nèi)源性或內(nèi)源性H2O2成像。通過(guò)12和13的雙重成像，線粒體H2O2的水平首先持續(xù)增加，而線粒體定向凋亡的ER H2O2的水平延遲上升。然而，在ER導(dǎo)向的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，ER是H2O2過(guò)量產(chǎn)生的主要部位，并且在線粒體中發(fā)現(xiàn)了H2O2水平的延遲升高。

Lee課題組開發(fā)了另一種ER靶向的近紅外探針14[45]。探針14(圖4)基于苯乙烯基萘二甲酰亞胺硼酸酯作為H2O2識(shí)別位點(diǎn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2。加入H2O2后，探針14的熒光強(qiáng)度在535處降低，并在640 nm處熒光增加。14與H2O2的熒光反應(yīng)可在10分鐘內(nèi)完成，溶液中的檢測(cè)極限為0.30μM。此外，還發(fā)現(xiàn)在thapsigargin(一種ER應(yīng)激誘導(dǎo)物)的存在時(shí)，探針14優(yōu)先積累在Hela細(xì)胞的ER中，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的H2O2水平升高。

圖4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向的H2O2探針

由于過(guò)氧化脂質(zhì)在腦細(xì)胞溶酶體中的積累可導(dǎo)致阿爾茨海默氏病，通過(guò)與溶酶體亞鐵的主要相互作用，過(guò)氧化氫的內(nèi)源性或外源性異常產(chǎn)生可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷[46]。因此，有效監(jiān)測(cè)和檢測(cè)溶酶體中的過(guò)氧化氫對(duì)生理學(xué)和細(xì)胞凋亡具有重要意義，因此一系列溶酶體靶向熒光探針被報(bào)道(圖5)。Lin等人開發(fā)了靶向溶酶體且快速響應(yīng)(60s)的H2O2熒光探針15[47]，其熒光增強(qiáng)了80倍。該探針具有較高的溶酶體共定位系數(shù)(0.96)同時(shí)可以對(duì)活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性H2O2進(jìn)行成像，并通過(guò)TP顯微鏡可以觀察到深度組織中H2O2的水平。

溶酶體是結(jié)合在膜上的酸性囊泡(pH 4～6)，因此，酸性pH可激活的熒光探針可以更好地檢測(cè)和可視化溶酶體中的H2O2，而不會(huì)受其他可能的熒光信號(hào)干擾[48-51]。2016年，Zhao等人開發(fā)了一種pH觸發(fā)的H2O2響應(yīng)的熒光探針16[52]，該探針可以在溶酶體pH下對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2O2進(jìn)行響應(yīng)。熒光探針由硼酸酯部分作為H2O2響應(yīng)基團(tuán)和螺苯并吡喃熒光團(tuán)作為pH可轉(zhuǎn)換位點(diǎn)組成。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)H2O2檢測(cè)，只能明顯地檢測(cè)到來(lái)自溶酶體區(qū)室的熒光發(fā)射，而其他區(qū)域的熒光發(fā)射則是不可見(jiàn)的，這是由于探針的特定pH觸發(fā)特性引起的。

在2017年，Zhao和他的同事還開發(fā)了另外一個(gè)溶酶體定位和酸性pH可觸發(fā)的熒光探針17，用于檢測(cè)和可視化溶酶體中的H2O2[53]。該探針由H2O2響應(yīng)基團(tuán)硼酸酯單元，pH值可激活的苯丙氨酸熒光團(tuán)和溶酶體定位的嗎啉基團(tuán)組成。值得注意的是，該探針無(wú)需外部刺激即可對(duì)HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性溶酶體H2O2進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)，而來(lái)自其他細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的信號(hào)干擾則可以忽略不計(jì)。

圖5 溶酶體靶向的H2O2探針

高爾基體的氧化應(yīng)激與大量ROS的產(chǎn)生和高血壓的進(jìn)展顯著相關(guān)。值得注意的是，H2O2，作為氧化應(yīng)激的指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)對(duì)于揭示高爾基氧化應(yīng)激的機(jī)制至關(guān)重要。Tang和他的同事開發(fā)了一種TP熒光探針18[54](圖6)，基于靶向高爾基體的新型苯磺酰胺基團(tuán)在活細(xì)胞和腎臟組織中可以對(duì)H2O2比例成像。值得注意的是，與不存在H2O2時(shí)相比，存在H2O2時(shí)F560nm/F470nm的比率增加了130倍。18成功檢測(cè)到高血壓小鼠腎臟中H2O2的水平增加。這項(xiàng)工作為揭示高爾基體氧化應(yīng)激與高血壓之間的關(guān)系以及將來(lái)治療高血壓的新藥物靶標(biāo)提供了理想的工具。

圖6 高爾基體靶向的H2O2探針

細(xì)胞核不僅是活細(xì)胞中最關(guān)鍵的細(xì)胞器，而且還包含絕大多數(shù)的DNA[55]。異常的ROS可以攻擊細(xì)胞核中的DNA，并誘導(dǎo)DNA堿基的氧化修飾，這與衰老，阿爾茨海默氏病和癌癥有關(guān)[56-58]。因此，ROS的核定位探針?lè)浅Ｖ匾?圖7)。2014年，Yi等人構(gòu)建了一種新型的核定位的比率型H2O2熒光探針19，該探針將NP1連接到核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)肽(VQRKRQKLMP-NH2)上[59]。 NLS肽已經(jīng)被用作有效的核傳遞載體。探針19可用作HeLa細(xì)胞中核H2O2的比例檢測(cè)。

在2019年，Yin及其同事開發(fā)了一種新的H2O2細(xì)胞核可視化探針20，該探針由H2O2熒光傳感器(NP1)和擴(kuò)展的NLS肽(pep6，CGGGGGVQRKRQKLMP)組成[60]。重要的是，由NP1和pep6組成的探針系統(tǒng)用于對(duì)HepG2細(xì)胞中刺激后的細(xì)胞核H2O2水平進(jìn)行成像。這種設(shè)計(jì)策略可能成為開發(fā)核定位熒光探針的未來(lái)設(shè)計(jì)方法。

圖7 ROS的核定位探針

3 總結(jié)與展望

我們總結(jié)了線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體以及細(xì)胞核靶向的基于硼酸鹽識(shí)別的H2O2熒光探針，同時(shí)討論了它們的靶向策略、熒光行為及其在生物成像中的應(yīng)用?？傊谂鹚猁}的H2O2局部檢測(cè)的探針已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。但是，靶向細(xì)胞器的H2O2熒光探針也有很大的優(yōu)化空間：(1)大多數(shù)報(bào)道的基于硼酸鹽的靶向細(xì)胞器的H2O2熒光探針的發(fā)射波長(zhǎng)通常分布在可見(jiàn)光區(qū)域，進(jìn)一步開發(fā)具有近紅外發(fā)射的靶向細(xì)胞器的H2O2熒光探針，這樣更有助于生物學(xué)研究中的應(yīng)用。(2)由于探針進(jìn)入特定細(xì)胞器所引起的生理狀態(tài)變化可能會(huì)導(dǎo)致這些探針從細(xì)胞器中逸出。因此，能夠結(jié)合特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括但不限于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體和DNA)的熒光探針的開發(fā)將提供準(zhǔn)確的定位和更精細(xì)的研究。我們深信，這些H2O2熒光探針將成為化學(xué)家、生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)科學(xué)家進(jìn)行疾病診斷和病理生理機(jī)制研究的強(qiáng)大工具。